Студ

Помощь

Пространственная динамика свертывания крови

Интегрированная Контрольная Работа 3 Класс

Оглавление


Введение

Глава 1. Обзор литературы

.1 Обзор современных представлений о свертывании

.2 Математические модели системы свертывания

Глава 2. Методы

Глава 3. Описание математической модели системы свертывания

.1 Математическая модель кинетики свертывания в реконструированных системах

.2 Математическая модель пространственной динамики свертывания в плазме

Глава 4. Исследование математической модели системы свертывания

.1 Регуляция свертывания ингибитором пути тканевого фактора

.2 Реакция активации фактора XI тромбином

.3 Влияние тромбоцитов и фосфолипидов на скорость реакций свертывания

.4 Влияние кинетических констант реакций свертывания на кинетику системы

Обсуждение результатов

Выводы

Список сокращений

Список использованной литературы


Введение


Биохимические и медицинские исследования последних десятилетий привели к значительному прогрессу в изучении ферментативных систем организма. Это в полной мере относится к системе свертывания крови, являющейся частью системы гемостаза, отвечающей за поддержание целостности кровеносной системы при повреждении стенки сосуда [7, 29, 55]. Первичная остановка кровотечения достигается за счет сокращения гладких мышц сосудистых стенок, которое вызывает уменьшение просвета сосуда, и за счет образования рыхлой тромбоцитарной пробки в месте повреждения. Затем срабатывает плазменная система свертывания, приводящая к локальному переходу плазмы крови из жидкого в гелеобразное состояние. В результате образуется прочный сгусток, полностью предотвращающий потерю крови до тех пор, пока не произойдет репарация повреждений.

Несмотря на обилие эмпирической информации об устройстве и функционировании системы гемостаза, наше понимание регуляции этого процесса далеко от ясности. Плазменная система свертывания крови включает десятки различных белков, сложным образом взаимодействующих друг с другом, с эндотелием сосудов и с клетками крови, в первую очередь, тромбоцитами. В свою очередь, тромбоциты могут активироваться под действием разнообразных агентов, выбрасываемых из разрушенных клеток, секретируемых уже активированными тромбоцитами или производимых системой свертывания, что ведет к адгезии активированных тромбоцитов к месту повреждения и агрегации, а также к изменениям в их клеточной мембране, которые позволяют реакциям свертывания происходить на ее поверхности [7, 37]. Наконец, необходимо учитывать, что задача создания локализованного сгустка является принципиально пространственной [1], что еще более усложняет интерпретацию экспериментальных результатов.

Сложность системы гемостаза делает математическое моделирование удобным и эффективным методом ее исследования. Модели могут служить как дополнением к экспериментальным исследованиям, средством для их планирования и объяснения их результатов, так и самостоятельным инструментом для исследования режимов поведения системы свертывания и прослеживания связи между устройством системы и ее функционированием [43]. Несмотря на то, что к настоящему моменту опубликовано более десятка различных моделей каскада свертывания, вследствие интенсивного развития биохимии свертывания схемы реакций, кинетические константы, верификационные данные, которые они используют, в значительной степени устарели. Настоящая работа посвящена построению и исследованию полной математической модели системы свертывания крови, включающей как внутренний, так и внешний пути активации, количественно описывающей существующие гомогенные и пространственные эксперименты.

Задачи исследования

. Провести анализ литературы и построить количественную модель свертывания крови, отвечающую современным биохимическим представлениям о системе свертывания и описывающую известные на настоящий момент экспериментальные данные по исследованию свертывания in vitro.

. Исследовать блоки реакций, представления о которых подверглись пересмотру в работах последних лет: блок реакций ингибитора пути тканевого фактора, активация фактора XI тромбином, участие различных типов поверхностей в поддержание реакций свертывания. Оценить их вклады в случаях гомогенной и пространственно неоднородной экспериментальной постановки.

. Исследовать зависимость поведения системы от изменения кинетических констант реакций и концентраций реагентов.


Глава 1. Обзор литературы


.1 Обзор современных представлений о свертывании


Во всех многоклеточных организмах, за исключением низших беспозвоночных, не обладающих ни кровью, ни гемолимфой, присутствуют механизмы гемостаза - системы, отвечающей за поддержание целостности повреждении сосудистой системы [96]. У млекопитающих выделяют два основных звена гемостаза: первичный, сосудисто-тромбоцитарный, и вторичный, плазменный гемостаз [7, 37]. При повреждении стенки сосуда первыми срабатывают механизмы вазоконстрикции и образования тромбоцитарной пробки за счет того, что при повреждении эндотелия в кровь попадают вещества, которые вызывают сужение сосудов и активацию тромбоцитов. Будучи активированы, тромбоциты, в норме имеющие форму пластинки, становятся шарообразными и приобретают способность к адгезии к месту повреждения и взаимной агрегации. В результате на месте повреждения образуется сравнительно рыхлая тромбоцитарная пробка, предотвращающая потерю клеток крови, но не плазмы. Характерное время срабатывания этих систем - несколько минут. На фоне этих событий развивается плазменный гемостаз, время срабатывания которого имеет порядок десятков минут. Его работа приводит к образованию плотного фибринового сгустка, полностью предотвращающего потерю крови. Спустя несколько часов вследствие сокращения волокон фибрина происходят дальнейшее уплотнение сгустка, ретракция, и далее, по мере репарации повреждений, лизис тромба.

In vivo все элементы системы гемостаза находятся в тесном взаимодействии. Так, тромбоциты могут быть активированы одним из главных белков системы свертывания, тромбином. В свою очередь, после активации они предоставляют фосфолипидную поверхность, необходимую для прохождения реакций системы свертывания, а также секретируют десятки веществ, воздействующих на все звенья гемостаза, в том числе факторы свертывания V и XI, фактор Виллебрандта, фибриноген и ряд ингибиторов свертывания [37]. Большую роль в регуляции гемостаза играет эндотелий сосуда, тесно взаимодействующий как с тромбоцитарной, так и с плазменной системами гемостаза. Тем не менее, в экспериментах in vitro эти системы могут быть успешно разделены и исследоваться самостоятельно. Поскольку настоящее исследование сосредоточено на моделировании плазменной системы свертывания, она будет далее рассмотрена наиболее подробно. Начало биохимической эпохи исследования свертывания принято связывать с работами Alexander Schmidt [76] и Paul Morawitz [59], которые датируются концом XIX - началом XX в. В них было высказано предположение, что основными этапами свертывания являются превращение неактивного ферментативного предшественника, протромбина, в тромбин под действием некоторого вещества (веществ), условно названного тромбокиназой, с последующим превращением фибриногена в фибрин под действием тромбина. В течение первой половины XX-го века изучение наследственных пороков свертывания и создание клинических тестов, позволяющих количественно охарактеризовать состояние системы свертывания, привели к открытию десятков веществ, участвующих в этом процессе (подробный обзор в [55]). В Таблице 1 приведены концентрации известных на настоящий момент факторов свертывания. В 1964 году в работах MacFarlane [54] и, независимо от него, Davie и Ratnoff [28] схема была усложнена: была предложена парадигма каскада, "водопада" реакций в плазме, ведущих к образованию фибрина, которая является базовой для исследователей в данной области уже на протяжении четырех десятилетий. С тех пор механизм еще более усложнился: единый каскад разделился на две ветви, внутренний и внешний пути активации свертывания, охваченные многочисленными петлями положительных и отрицательных обратных связей и перекрестными взаимодействиями.

Таблица 1. Средние плазменные концентрации основных факторов свертывания (по [55])

НазваниеКонцентрация, нМНазваниеКонцентрация, нМФибриноген8800Фактор XII375Фактор II1400Прекалликреин 450Фактор V20HK6000Фактор VIIa0.1Фактор XIII 70Фактор VII10Протеин C60Фактор VIII0.7Протеин S300Фактор IX90TFPI2.5Фактор X170Антитромбин III3400Фактор XI30

В 1949 году Seegers показал [77], что для свертывания необходимо наличие в системе фосфолипидов. Последующие исследования привели к выводу, что почти все реакции свертывания требуют для своего эффективного прохождения наличия отрицательно заряженной фосфолипидной мембраны. Ее могут предоставлять липопротеины плазмы [36], поврежденные фрагменты тканевых клеток [55], мембраны активированных тромбоцитов [99], тромбоцитарные микровезикулы [79], мембраны клеток иммунной системы [83]. Достоверно известно, что в случае некоторых заболеваний эритроциты также могут предоставлять прокоагулянтную поверхность [10]. Есть данные [65], что они могут играть важную роль и в норме, однако это утверждение пока является спорным [99]. Общепринятым же является мнение, что основной вклад в прокоагулянтную активность in vivo в норме вносят тромбоциты [79, 99]. В экспериментах in vivo в качестве прокоагулянтной поверхности часто используют фосфолипидные везикулы из фосфатидилсерина и фосфатидилхолина в соотношении 1:3 [98].

На Рис. 1 приведена упрощенная схема современных представлений о каскаде реакций свертывания. Активация каскада может происходить двумя способами - по внешнему (путь тканевого фактора) или внутреннему пути (путь контактной активации). Внутренний путь активируется при контакте плазмы с чужеродной поверхностью. Классическим активатором in vitro служит стекло. В результате cложной сети реакций с участием XII фактора, высокомолекулярного кининогена и прекалликреина происходит активация XII фактора, который затем активирует фактор XI [66]. Поскольку наблюдаемые в клинике дефициты факторов контактной активации (фактор XII, высокомолекулярный кининоген и прекалликреин) не связаны со склонностью к кровотечениям [55], считается, что физиологически значимым является внешний путь.


Рис. 1. Упрощенная схема реакций системы свертывания. Обозначения схемы: PK, прекалликреин; К, калликреин; HK, высокомолекулярный кининоген; PC, протеин С; TF, тканевый фактор. Суффикс "a" означает активированную форму фермента


В мембранах клеток всех тканей организма (за исключением клеток, находящихся в контакте с кровью - эндотелия сосудов кровеносной системы и форменных элементов крови) присутствует интегральный гликопротеин тканевый фактор (TF). При повреждении эндотелия плазма вступает в контакт с клетками этих тканей, и факторы VII и VIIa, присутствующие в плазме, связываются с TF, образуя комплекс на поверхности мембраны [48]. В норме примерно 1-2% фактора VII, присутствующего в плазме крови, являются активированными. Однако, активный центр свободного фермента не работоспособен, и сам по себе фактор VIIa практически не обладает каталитической активностью, то время как комплекс VIIa-TF способен активировать, путем отщепления небольшого пептида от аминотерминального конца тяжелой цепи, факторы IX и X в активные сериновые протеазы [47]. Фактор Ха, в свою очередь, расщепляет белок протромбин, превращая его в тромбин в очень медленной реакции [72]. Наработанные малые количества тромбина могут активировать факторы VIII и V, которые после активации становятся кофакторами факторов IXа и Ха в реакциях активации фактора X и тромбина, соответственно. Это осуществляется путем образования на фосфолипидной поверхности в присутствии ионов кальция комплексов внутренней теназы IXa-VIIIa и протромбиназы Xa-Va. Эти комплексы способны активировать фактор X и протромбин приблизительно на 3-5 порядков быстрее, чем IXa и Xa, соответственно, сами по себе [72, 84].

Тромбин является центральным ферментом системы свертывания, участвующим в многочисленных реакциях. Главной из них является расщепление белка фибриногена в сложной многоступенчатой реакции с превращением его в фибрин, способный полимеризоваться с образованием разветвленных структур [38]. Попутно, тромбин активирует фактор XIII, который образует поперечные сшивки между молекулами фибрина [24].

Фактор Xa также может активировать факторы V и VIII, но значительно менее эффективно, нежели тромбин [53, 57]. Физиологическая важность этих реакций пока неясна. Еще одна положительная обратная связь, роль которой сейчас активно обсуждается, - активация тромбином фактора XI [13, 34, 94]. Кроме того, как тромбин, так и фактор Xa способны эффективно активировать фактор VII, превращая его в VIIa [26].

Для обеспечения устойчивого стационарного неактивированного состояния и для уничтожения активных факторов после завершения свертывания в системе присутствуют многочисленные стехиометрические ингибиторы, которые связываются с активными факторами и ингибируют их деятельность. Ключевыми среди стехиометрических ингибиторов являются антитромбин III и ингибитор пути тканевого фактора, TFPI [88]. Первый из них блокирует активность тромбина, факторов IXa, Xa, XIa, VIIa. Дефицит его приводит к тромбозам [88]. Второй связывается с фактором Xа и внешней теназой, ингибируя обе протеазы и являясь основным регулятором активности комплекса VIIa-TF [22, 69]. Дефицит TFPI в клинике не наблюдался, предположительно, из-за несовместимости с жизнью [15]. Ингибирующее действие TFPI реализуется довольно сложным образом, вовлекая в процесс ингибирования основной продукт работы комплекса VIIa-TF фактор Ха [23, 68]. Более подробно механизм действия TFPI обсуждается в разделе 4.1.

Тромбин также ингибируется кофактором гепарина II и альфа-2-макроглобулином, но в значительно меньшей степени, нежели антитромбином [88]. Некоторый вклад в ингибирование различных протеаз каскада свертывания вносят также альфа1-антитрипсин, С1-ингибитор и ингибитор протеина С [92].

Каскад охвачен петлей отрицательной обратной связи, так называемым путем протеина С [87]. Будучи активированным тромбином, протеин C инактивирует факторы Vа и VIIIа, резко снижая скорость образования тромбина и фактора Xа соответственно. Кофактором в этом расщеплении служит протеин S, важный антикоагулянт, присутствующий в плазме. Кроме того, что он ускоряет реакции инактивации, он помогает активированному протеину С (PCa) расщепить фактор Va в протромбиназе, чего в его отсутствие не происходит [80]. Кроме того, протеин S обладает независимым от протеина С механизмом антикоагулянтного действия, предположительно, за счет конкуренции с протромбиназой и теназой за место на мембране [86].

В заключение представляется необходимым упомянуть о влиянии стенок сосудов на свертывающую систему крови, поскольку in vivo оно имеет большое значение. Сосудистая стенка принимает непосредственное участие в регуляции потенциала свертываемости крови. Помимо того, что она служит естественным барьером между кровью и другими тканями, ее клетками синтезируются и/или экспрессируются различные биологически активные вещества, модулирующие тромбообразование. К ним относится фактор Виллебранда, эндотелиальный фактор релаксации (NO), простациклин, тромбомодулин, эндотелин, тканевый фактор, ингибитор пути тканевого фактора и другие [3]. Кроме того, мембраны эндотелиоцитов несут на себе рецепторы, которые при определенных условиях связывают молекулярные лиганды и клетки, свободно циркулирующие в кровотоке. Очень многие аспекты жизнедеятельности этих клеток регулируются тромбином через его взаимодействие со специфическими поверхностными рецепторами. В норме стенки обладают ярко выраженной антитромботической активностью, механизмы которой не вполне ясны. Известно, что с их поверхностью постоянно связано большое количество антитромбина III, а также TFPI, полное содержание последнего на стенках по меньшей мере не уступает пулу плазмы [15]. На поверхности клеток эндотелия содержится трансмембранный белок тромбомодулин, связывающий тромбин и производящий поразительные изменения в его специфичности [32]. В комплексе с тромбомодулином тромбин в сильной степени теряет свои прокоагулянтные свойства, взамен резко возрастает его способность активировать протеин С: скорость активации возрастает на три-четыре порядка.

По всей видимости, перечисленные свойства сосудистой стенки играют важную роль в механизме локализации тромба in vivo.

свертывание кровь модель тромбоцит

1.2 Математические модели системы свертывания


Ограниченность объема данной работы не позволяет подробно осветить все аспекты истории математического моделирования в исследованиях системы свертывания. Поэтому работы, связанные с моделированием отдельных реакций системы или их небольших блоков (такие, как классическая модель протромбиназы [61]), не будут рассматриваться; из моделей, описывающих тромбоцитарный гемостаз, будет рассмотрена только одна [50], поскольку в ней основное внимание уделяется плазменному звену. Главным образом, в настоящем обзоре будут обсуждаться механизменные математические модели системы свертывания, схемы реакций которых включают большую часть каскада свертывания.

Первые математические модели системы свертывания появились сразу же после возникновения представления о ее каскадной структуре [54]. В работе [52] рассматривалась кинетика однородного ферментативного каскада N реакций второго порядка. Активация системы производилась постоянным возмущением первого фактора каскада на протяжении времени a. Каждый из факторов каскада ингибировался в реакции псевдопервого порядка. В работе было показано, что ответ такой системы (кинетика последнего из факторов) должен иметь импульсный вид и быть пропорциональным уровню активации. Начальная кинетика будет степенной, причем показатель степени определяется количеством ступеней каскада.

Последующие исследования обнаружили наличие многочисленных петель положительных и отрицательных обратных связей в каскаде свертывания. В работе [56] была предпринята попытка развить модель [52], дополнив ее учетом роли фибринолиза и адсорбции тромбина на фибрине, как петель отрицательной обратной связи.

Принципиальную роль в истории вопроса сыграла модель [45], в которой рассматривалось влияние петли положительной обратной связи, активации фактора V тромбином, на кинетику системы. Активация и ингибирование факторов свертывания учитывались с помощью кинетики псевдопервого порядка. Основным результатом работы была демонстрация нелинейности ответа такой системы при изменении уровня активации. Подпороговые уровни активации вызывали слабые ответы, в то время как запороговая активация вызывала срабатывание каскада усиления и взрывное формирование фибрина. Такое поведение системы представляется физиологически разумным, предохраняющим организм от образования спонтанных тромбов.

Все перечисленные модели исследовали "абстрактные" системы уравнений, соответсвующие схемам реакций, имеющим лишь отдаленное сходство с системой свертывания. В 1991 г. впервые была предложена количественная модель свертывания [91], в которой использовалась схема реакций, соответствующая биохимическим представлениям того времени, кинетические константы реакций были взяты из литературных данных, а результаты (кинетика тромбина и фактора Va) сопоставлялись с экспериментом. Объектом моделирования являлась рекальцифицированная дефибринированная плазма, в которую были добавлены фосфолипиды в качестве источника поверхности для реакций. Активация системы производилась по внешнему пути. Поскольку устройство начальных реакций свертывания было изучено не очень хорошо, моделировался лишь участок каскада от образования фактора Xa до образования тромбина с учетом активации тромбином фактора V и протеина C. Экспериментально наблюдавшаяся кинетика фактора Xa была аппроксимирована функцией вида



Было показано, что такая система обладает порогом по концентрации фактора Xa (пороговое значение константы А было 1-10 пМ при ?=1 мин-1). При исследовании влияния констант реакций на порог, было также показано, что скорости инактивации фактора Xa и протромбиназы сильнее влияют на это значение, чем скорости инактивации тромбина или активации протеина С.

Модель [67], как и предыдущая, является количественной. В отличие от [91], однако, в ней рассматривался весь процесс свертывания по внешнему пути - от связывания тканевого фактора с фактором VIIa до образования фибрина. Внутренняя теназа, фактор XI, протеин С в модели не учитывались. Это однако, нельзя считать недостатком, поскольку объектом моделирования был тест протромбинового времени, активация свертывания в разбавленной плазме большими концентрациями тканевого фактора в присутствии избытка кальция. Из клинической практики известно [4], что тест протромбинового времени нечувствителен к колебаниям в концентрациях этих факторов. Неизвестные константы реакций были определены с помощью ?2 аппроксимации результатов теста протромбинового времени для больных с различными дефицитами факторов свертывания. Модель была ориентирована на использование для интерпретации клинических данных.

Новый подход к вопросу был продемонстрирован в [43]. Вместо того, чтобы моделировать кровь или плазму, чрезвычайно сложные системы, авторы попробовали количественно описать события, происходящие в системе очищенных белков, включающей основные факторы свертывания - IX, X, V, VIII, II - в плазменных концентрациях, а также фосфолипиды и кальций. Ингибиторов в модели не было. Инициация производилась по внешнему пути добавлением пикомолярных концентраций комплекса TF-VIIa. Для расчетов использовались измеренные экспериментально константы реакций, некоторые из них варьировались, чтобы добиться согласия с результатами эксперимента. Все фермент-субстратные комплексы рассматривались как независимые переменные, для этого скорости их образования были введены в модель искусственно, а скорости диссоциации рассчитаны на основании известных констант Михаэлиса и каталитической. Кроме того, сравнение результатов с экспериментом потребовало от авторов введения искусственной деградации комплекса внутренней теназы, чтобы удержать его концентрацию на уровне не более 3 пМ.

В отличие от моделей [52, 56, 45], эта работа ставила перед собой вполне конкретные, чисто биохимические задачи. Основным результатом является утверждение, что рассмотренных в модели реакций достаточно для описания наблюдаемых в экспериментальной системе закономерностей. В некотором смысле, была подведена черта под представлениями об устройстве основного участка системы свертывания и последовательности событий, происходящих при активации. Кроме того, в работе было показано, что концентрация активатора сильнее влияет на задержку роста тромбина, чем на максимальную скорость, что фактор VIII и внутренний путь в целом становятся важными при малых концентрациях активатора и сильно влияют на кинетику системы после первых 40 сек процесса, что, наконец, фактор Xa и тромбин являются одинаково эффективными активаторами фактора V, но активация фактора VIII тромбином намного важнее, чем активация фактором Xa.

Эта модель была незначительно модифицирована другими авторами [51] в целях клинических исследований с тем, чтобы оценить эффект антитромботической терапии ингибиторами сериновых протеаз. Было показано, что присутствует хорошая корреляция между влиянием препарата на кинетику тромбина в модели и его влиянием на свертывание in vivo у крыс, которым вводили препарат. В качестве показателя состояния системы свертывания in vivo использовался тест активированного частичного тромбопластинового времени. В этом тесте в плазму добавляются большие концентрации фосфолипидов и активатора внутреннего пути и регистрируется время свертывания: тест является стандартным методом мониторинга антикоагулянтной терапии [3].

Возврат к моделированию "абстрактных" систем на более глубоком уровне произошел в работе [20]. В ней была рассмотрена иерархическая последовательность четырех усложняющих систем реакций, имитирующих систему свертывания. Первая состояла лишь из двух ферментов, взаимно активирующих друг друга, в то время как последняя содержала две последовательные положительные обратные связи, а также так называемую "дальнюю" (long-range) петлю (активация первого фермента каскада последним), имитирующую активацию фактора XI тромбином. Для первых трех систем, поддающихся точному анализу, были определены формулы зависимости порога по активации от констант системы. Последняя из систем исследовалась численно. Для дальней петли наблюдались два эффекта: при высокой скорости она была способна вызвать возбуждение даже при той концентрации активатора, которая иначе была бы подпороговой. При низкой скорости она не влияла на порог, но потенцировала ответ при запороговой активации.

В другой "абстрактной" работе [40] система свертывания была исследована с точки зрения контролируемости и стабильности. Модель основывалась на биохимической схеме реального каскада, однако константы скоростей реакций соответствовали истинным с точностью до порядка-двух. Затем система уравнений была линеаризована и подвергнута анализу. Было показано, что система свертывания неконтролируема в том смысле, что внешние воздействия после активации слабо влияют на ее эволюцию.

Модель [46] была предложена в 1998 г. для описания стандартного клинического теста протромбинового времени. Путь протеина С и активация фактора XI тромбином не рассматривались. Реакции считались подчиняющимися кинетике Михаэлиса-Ментен, образование комплексов теназы и протромбиназы считалось необратимой реакцией, константы реакций были взяты из литературы. Были исследованы кинетика факторов свертывания и чувствительность теста к концентрациям их предшественников. Модель предсказала, что лишь сильные дефициты факторов (<20%) могут быть обнаружены с помощью теста. Сравнение результатов расчетов с результатами экспериментов не проводилось.

Следующая работа из той же лаборатории [2] опиралась на экспериментально полученные параметры реакций, но верификация не проводилась. Рассматривалось свертывание in vivo, в потоке. В модели впервые было введена идея примембранного слоя, внутри которого существует полное перемешивание и идет свертывание. Между слоем и потоком происходит диффузионный обмен веществом. В работе было показано, что поток крови может оказывать воздействие на динамику образования тромба и служить регулятором его роста.

Наиболее обширная и детальная на настоящий момент модель свертывания, включающая свыше 50 дифференциальных уравнений, была предложена в 2001 г. в работе [50]. Модель основывалась на кинетических параметрах, приведенных в литературе или полученных на основании косвенных оценок, но верификация и сравнение с экспериментами не проводились. Как и предыдущая модель, она рассматривала свертывание in vivo и использовала понятие примебранного слоя, в котором происходит настолько эффективное перемешивание, что его можно считать полным и в его пределах использовать обыкновенные дифференциальные уравнения. В отличие от всех предыдущих работ, в [50] вводится детальное описание взаимодействия факторов свертывания с тромбоцитами и активация тромбоцитов. Основные выводы модели: 1) система отвечает пороговым образом на изменение концентрации тромбоцитов, 2) предложен возможный механизм ингибирования тканевого фактора с помощью адгезии тромбоцитов на стенку сосуда.

Несмотря на беспрецедентную детальность, модель [50] имеет серьезные недостатки, которые при отсутствии верификации подвергают сомнению достоверность ее выводов. Модель не включает фибриноген и фибрин и, соответственно, не учитывает тот факт, что значительная доля тромбина связывается с фибрином и фибриногеном [38]. Кроме того, отсутствие конечного продукта, фибрина, не позволяет делать обоснованные выводы о влиянии различных факторов на строение сгустка, но только на кинетику тромбина. Модель также не включает фактор XI, однако его отсутствие в организме приводит к кровотечениям, гемофилии С. Несмотря на то, что в модель включены тромбоциты, механизм их взаимодействия с ферментами каскада не соответствует современным экспериментальным данным: в модели считалось, что каждый активный фактор конкурирует со своим предшественником за специфичное только для этих двух белков место связывания на тромбоците. Однако, хорошо известно [37], что факторы свертывания практически не конкурируют за места связывания (в том числе и со своими предшественниками), имея не более 10-20% общих с другими факторами мест связывания. Единственное исключение - два предшественника, факторы II и X, имеют общее место связывания. [76]. Фактор VIII в норме вообще не может садиться на тромбоцит [9], и еще в середине 80-х было показано, что Xa фактор садится не на рецептор, а на предварительно связанный фактор Va 83. Модель включает активацию тромбоцитов как с помощью АДФ, так и с помощью тромбина, но известно что активация АДФ не приводит к появлению прокоагулянтной поверхности [99].

Все рассмотренные модели были посвящены исследованию гомогенных систем, которые также являются наиболее изученными экспериментально. В то же время, задача образования плотного локализованного фибринового сгустка является принципиально пространственной. В 1994 г. была предложена феноменологическая модель образования сгустка в пространстве [1], в которой было сформулировано автоволновое представление о процессе свертывания. Она включала два уравнения в частных производных. Первая переменная соответствовала условному "активному веществу" (реальный аналог - тромбин), вторая - условному "ингибитору" (протеин С). В модель было введено предположение о существовании автокаталитической наработки ингибитора, что приводило к возникновению двух автоволн, активатора и ингибитора. Волна ингибитора нагоняла волну активатора и останавливала рост тромба. С помощью этой модели был качественно описан ряд наблюдавшихся в эксперименте режимов: образование тромбов фиксированного, не зависящего от активатора размера, образование слоистых тромбов.

Позднее в той же лаборатории была развита количественная модель [11], описывающая гомогенную кинетику свертывания при активации по внутреннему пути. Уникальной особенностью модели был учет зависимости скорости реакций от концентрации кальция. Было показано, что система должна отвечать пороговым образом на изменение концентрации кальция.

Дальнейшему развитию этой модели и исследованию ее поведения в пространстве была посвящена работа [94]. В ней количественно описывается и сравнивается с экспериментом как гомогенная, так и пространственная динамики системы при активации по внутреннему пути. Большая часть констант реакций системы была взята из экспериментальных данных, за исключением нескольких констант, которые не были обнаружены в литературе и варьировались до получения согласия с экспериментом. Инициация свертывания моделировалась постоянным втоком фактора XI с левой границы в пространственном случае и его стационарной концентрацией в гомогенном. В модели была предложена гипотеза о существовании пептида, отщепляемого от протеина С тромбином при активации и переводящего тромбин в антикоагулянтное состояние, идентичное комплексу тромбин-тромбомодулин. Введение такого механизма обеспечивало автокаталитическое образование ингибитора и приводило к возникновению ряда режимов, аналогичных [1]. Исследовалось влияние на кинетику констант реакций активации протеина С и фактора XI тромбином. Было показано, что реакция активации фактора XI тромбином при малых скоростях, не влияющих на гомогенную кинетику, может определять пространственную динамику системы. Система уравнений была редуцирована до трех переменных с помощью теоремы Тихонова, обезразмерена и подвергнута детальному исследованию, результаты которого изложены в [95]. Переменными редуцированной модели были тромбин, протеин С и фактор XIa, первые две переменные были автокаталитическими. Было показано существование в такой системе ряда необычных режимов: распространяющийся в пространстве и затем останавливающийся импульс, бегущий импульс с переменной амплитудой.

Несмотря на то, что математическое моделирование процесса свертывания крови имеет длительную историю, на настоящий момент в этой области исследования существуют существенные пробелы. Так, в большинстве работ, рассмотренных выше, проводится лишь качественное исследование моделей; верификация экспериментом проводится лишь в некоторых из них, причем почти всегда для каких-либо искусственных и упрощенных экспериментальных случаев: реконструированная система очищенных белков [43], дефибринированная плазма с добавленными фосфолипидами [91], плазма в тесте протромбинового времени [67]. Несмотря на то, что в организме основным путем активации является внешний, опубликованные модели пространственной динамики рассматривают только внутренний путь [94]. Наконец, успешные экспериментальные исследования последних лет привели к появлению многочисленных новых результатов, изменивших как наши представления о механизмах реакций свертывания, так и численные значения параметров известных ранее реакций, что не нашло пока отражения в модельных работах.


Глава 2. Методы


Численное интегрирование системы обыкновенных дифференциальных уравнений для модели свертывания в системе с перемешиванием производилось вложенным методом Рунге-Кутты-Фельберга порядка 2(3) [8] с помощью специально написанной программы на языке Watcom C++ 10.0. Идея вложенных методов Рунге-Кутты состоит в построении формул, которые давали бы два значения искомой функции в каждой последующей точке: некое приближенное численное значение y и более точное выражение . С помощью последнего можно на каждом шаге управлять погрешностью и длиной шага. Метод Рунге-Кутты-Фельберга 2(3) дает два приближенных решения - второго и третьего порядка точности. Они сравниваются, и, если различие превышает априори заданную точность, шаг уменьшается. Приведем рабочие формулы метода для начальной задачи вида



Они имеют вид:


(1)


где h - шаг метода.

Заданная наперед погрешность ? составляла 0.01 в следующей норме:

(2)


При численном интегрировании дифференциальных уравнений в частных производных для пространственной задачи была использована следующая схема. Отрезок длиной L, на котором производилось интегрирование, разбивался на N точек. Для дифференциального уравнения в частных производных вида


(3) использовалась пространственная дискретизация

(4)


Для использовалась аппроксимация Нумерова [8]:


,(5)


приводящая к разностной схеме четвертого порядка точности по пространству. Правая часть полученной системы дифференциально - разностных уравнений решалась вложенным методом Рунге-Кутты-Фельберга 2(3) [8].

На границах отрезка были заданы условия не протекания второго порядка для всех переменных, за исключением переменных, соответствующих факторам свертывания, взаимодействующих с факторами на поверхности. Взаимодействие учитывалось следующим образом: пусть переменная отвечает реагенту, взаимодействующему с реагентами на левой стенке сосуда и в объеме в некоторой реакции, такой, что скорость изменения описывается функцией поверхностных переменных и объемных . Тогда граничное условие для имеет вид


(6)


где - коэффициент диффузии фактора , или в дискретном виде


(7)


Для расчета поверхностных переменных также использовался метод Рунге-Кутты-Фельберга 2(3). Используемый численный метод дает второй порядок точности по времени и по пространству.

Задача интегрирования системы уравнений рассматривалась на отрезке прямой длиной L=3 мм, разбитом на 200 точек, заданная погрешность ?=0.01 в той же норме, что и для гомогенных систем.


Глава 3. Описание математической модели системы свертывания


.1 Математическая модель кинетики свертывания в реконструированных системах


Математическая модель гомогенной кинетики свертывания крови представляла собой систему обыкновенных дифференциальных уравнений. Переменными модели были изменяющиеся во времени концентрации факторов свертывания. Дифференциальные уравнения модели были выписаны на основе закона действующих масс. Ферментативные превращения учитывались с помощью справедливой в широком диапазоне концентраций формулы [5] для скорости ферментативной реакции с несколькими субстратами, конкурирующими за один фермент


(8)


где и являются константами, характеризующими превращение j-го субстрата Sj в j-й продукт Pj под действием фермента E в реакции, подчиняющейся кинетике Михаэлиса. Реакции ассоциации, диссоциации и ассоциации с ингибиторами сериновых протеаз (антитромбин III и другие) описывались с помощью кинетики второго, первого и псевдопервого порядка соответственно. Во всех расчетах, если не обозначено иное, начальные концентрации активных факторов (кроме фактора VIIa) были равны нулю, а концентрации неактивных предшественников соответствовали приведенным в Таблице 1.

Ниже приведены уравнения модели, описывающей свертывание в гомогенных системах очищенных белков, имитирующих плазму. Эти реконструированные системы экспериментально исследовались в работах [43, 87, 88]. Результаты этих исследований были использованы для последовательного построения и верификации модели.

Блок реакций внешней теназы


(9)

(10)

(11)

(12)

(13)


Активация факторов IX и X


(14)

(15)

(16)

(17)

(18)

(19)

(20)


Образование тромбина


(21)

(22)

(23)


Активация кофакторов, факторов VIII и V


(24)

(25)

(26)

(27)


Сборка мембранных комплексов


(28)

(29)


Путь протеина С


(30)

(31)


Антитромбин


(32)


Путь TFPI


(33)

(34)

Если специально не оговорено, кинетические константы реакций модели соответствовали Таблице 2.


Таблица 2. Кинетические константы реакций, входящих в модель гомогенной кинетики свертывания.

КонстантаЗначениеRef.Блок реакций внешней теназы VIIa-TF, 1 нМ-1мин-1, 0.01 мин-1

=0.01 нМсм. текст (раздел 3.1) [90]0.1 нМ-1мин-1, 0.01 мин-1 *см. текст (раздел 3.1),912 мин-1, 1200 нМ *[26], 3.66 мин-1, 2700 нМ * [26], 5 нМ-1 мин-1, 942 мин-1 *см. текст (раздел 3.1), 5 нМ-1 мин-1, 770 мин-1 *см. текст (раздел 3.1), 5 нМ-1 мин-1, 770 мин-1 *см. текст (раздел 3.1)Активация IX и X, 108 мин-1, 210 нМ *

.6 мин-1, 243 нМ

.1-108 мин-1, 16-82 нМ

мин-1, 22 нМ

мин-1, 210 нМ

мин-1, 254 нМ

[97]

[47]

[21]

[89]

[16], 435 мин-1, 238 нМ *

-186 мин-1, 230-542 нМ

мин-1, 205 нМ

мин-1, 550 нМ

мин-1, 238 нМ

[47]

[89]

[21]

[17], 0.79 мин-1, 10110 нМ *

.79 мин-1, 10110 нМ

.04734 мин-1, 1830 нМ

[70]


[84]1740 мин-1, 4000 нМ *

мин-1, 190 нМ

мин-1, 83 нМ

[70]

[84]Образование тромбина4.1 мин-1, 1080нМ *[72]7000 мин-1, 1000 нМ *см. текст (раздел 3.1)2000 мин-1, 2000 нМ *см. текст (раздел 3.1)5 нМ-1мин-1 *см. текст (раздел 3.1)Активация VIII и V54 мин-1, 147 нМ *[39]54 мин-1, 147 нМ *см. текст (раздел 3.1)0.31 мин-1 *

.31 мин-1

[63]14 мин-1, 71.7 нМ *

мин-1, 71.7 нМ

=0.216 мин-1нМ-1

[57]

[81]70 мин-1, 71.7 нМ *

=1.08 мин-1нМ-1см. текст (раздел 3.1)

[81]Сборка комплексов 100 нМ-1мин-1, 100 мин-1 *

>100 нМ-1 мин-1

=0.73 нМсм. текст (раздел 3.1)

[49]


[60]100 нМ-1 мин-1, 100 мин-1 *

=0.074-2.4 нМ

[62]Путь протеина C1.2 мин-1, 60000 нМ *[32]1.2 мин-1, 60000 нМ *[32]1.2 нМ-1 мин-1 *[80]Антитромбин0.00006 нМ-1мин-1 *[44]0.0003 нМ-1мин-1 *[31]0.0004 нМ-1мин-1 *[41]0.0004 нМ-1мин-1 *[78]Путь TFPI, 0.44 нМ-1мин-1, 0 мин-1 *

.44 нМ-1мин-1, 0 мин-1

0.64 нМ-1мин-1

[18]

[42], 0.052 нМ-1мин-1, 0.02 мин-1 *

.052 нМ-1мин-1, 0.02 мин-1

0.96 нМ-1мин-1, 0.02 мин-1

[18]

[42], 6 нМ-1мин-1, 0.02 мин-1 *см. текст (раздел 4.1)20 нМ-1мин-1 *см. текст (раздел 4.1)

В случае, когда приведено несколько различных значений констант, для модели выбирались значения, полученные в условиях, наиболее близких к условиям моделируемых систем (человеческие белки, 37 С, pH 7.4, 150 мМ NaCl, 2 мМ CaCl2, 200 мкМ фосфолипидных везикул из фосфатидилхолина и фосфатидилсерина в соотношении 3:1). Рассмотрим более подробно механизмы отделньых реакций модели и выбор кинетических констант настоящей работы.

Блок реакций внешней теназы

. Ассоциация фактора VII(VIIa) и TF.

Мы не смогли обнаружить в литературе кинетических констант для ассоциации фактора VII(VIIa) и TF. В ряде работ они были измерены для растворимого TF, не имеющего трансмембранного домена, но известно, что аффинность связывания полноразмерного TF и фактора VIIa отличается на несколько порядков от аффинности растворимого TF [90]. Известно также, что параметры связывания факторов VII и VIIa с TF примерно одинаковы [12]. Поэтому в настоящей работе константы ассоциации фактора VII и TF считались равными константам для VIIa, константа диссоциации была выражена через известное значение равновесной константы диссоциации Kd [90] и константы ассоциации , а было найдено с помощью варьирования (Рис. 2).


Рис. 2. Активация 500 нМ фактора X добавлением 1.25 пМ TF и 100 пМ VIIa в присутствии (?) и в отсутствие (?) фактора VII (10 нМ).


Константа = 0.01 мин-1 была подобрана варьированием с помощью данного графика. Остальные константы соответствуют Таблице 2. Экспериментальные данные взяты из работы [85].

2. Реакции активации фактора VII.

Фактор VII может активироваться факторами Xa, VIIa-TF, IXa и IIa [26]. При этом фактор Xa на порядки эффективнее остальных активаторов ( =84 мин-1, =3200 нМ; =19.2 мин-1, =1700 нМ, данные для тромбина и фактора Xa приведены в Таблице 2). Однако, в более поздней работе [25] было показано, что тромбин также может играть заметную роль в активации фактора VII, предположительно, в силу его высоких концентраций в системе.

Предварительные расчеты (данные не показаны) показали, что скорость активации фактора VII фактором IXa и VIIa-TF пренебрежимо мала, поэтому в модели учитывается только активация фактора VII тромбином и Xa.

В системе свертывания активность многих ферментов распределена между несколькими субстратами. В особенности это касается тромбина, который активирует факторы VIII, V, VII, XI, протеин С в реконструированных системах, а в крови также факторы I, XIII и тромбоциты. Вообще говоря, для скорости реакции активации фактора VII тромбином в реконструированных системах справедлива формула

(35)


которая учитывает конкуренцию между всеми субстратами за фермент и возможность того, что концентрация субстрата может быть меньше концентрации фермента. Однако, при существующих значениях констант реакций, входящих в формулу, можно пренебречь практически всеми величинами в этой формуле с точностью, не уступающей точности исходной формулы. При этом формула упрощается до


(36)


То же приближение использовано для реакций активации перечисленных выше субстратов тромбина.

Те же рассуждения применимы к другому ферменту с многочисленными субстратами, фактору Xa. Однако, в отличие от тромбина, концентрации фактора Xa очень малы по сравнению с константой Михаэлиса. Поэтому выражение для активации фактора VII фактором Xa имеет вид


(37)


где второе слагаемое в знаменателе учитывает, что значительная часть фактора Xa оккупирована в фермент-субстратном комплексе с протромбином.

Активация факторов IX и X.

. Ассоциация VIIa-TF и IX, X.

Как описано ниже в разделе 4.1, посвященном пути TFPI, мы были вынуждены ввести дополнительные гипотетические реакции, чтобы описать эффект TFPI. Для этого мы рассматривали комплексы X-VIIa-TF, IX-VIIa-TF и Xa-VIIa-TF как отдельные переменные, в отличие от всех остальных фермент-субстратных комплексов модели, которые исходно были редуцированы. Мы не смогли обнаружить в литературе кинетических констант для сборки фермент-субстратных комплексов внешней теназы. В модели их ассоциация считалась быстрой (5 нМ-1мин-1) на основании [43], а константа диссоциации рассчитывалась из , .

. Активация факторов IX и X внешней теназой.

Литературные данные для констант активации этих факторов дают значения, довольно сильно различающиеся между собой (см. Таблицу 2). Наиболее вероятной причиной расхождения представляется нелинейная зависимость параметров этих реакций от концентрации фосфолипидов и использование различными авторами различных источников тканевого фактора и разной степени его очистки. Сравнение результатов работ [85] и [17] показало, что тканевый фактор моделируемых работ по очищенным системам [43, 87, 88], по-видимому, содержит около 18% активности. Поэтому для расчетов были взяты кинетические константы, указанные в Таблице 2, а концентрации тканевого фактора, взятые в эксперименте, уменьшались в 6 раз.

. Активация фактора IX фактором XIa.

Кинетические константы реакции была взяты из экспериментальных данных работы [89] и не варьировались.

. Активация фактора X фактором IXa и внутренней теназой.

Выбор кинетических констант для внутренней теназы подробно рассмотрен в разделе 4.3.

Образование тромбина.

Превращение протромбина в тромбин требует последовательного расщепления двух пептидных связей. В зависимости от порядка расщепления, образуются два различных промежуточных продукта, каталитически активный мезотромбин и неактивный претромбин 2 [81]. В очищенных системах первый образуется в основном при активации фактором Xa, второй - при активации комплексом Xa-Va, в крови мезотромбин практически не образуется [82]. Мезотромбин обладает отличной от тромбина активностью по отношению к различным естественным субстратам (см. Таблицу 1) и способен расщеплять субстрат Spectrozyme TH с каталитической активностью на 20% большей, чем тромбин [43], поэтому в экспериментах по очищенным системам, строго говоря, наблюдается не тромбин, а . Константы для различных этапов активации тромбина измерены в немногочисленных работах [72] в условиях, сильно отличающихся от условий в моделируемых системах. Поэтому константы, указанные в Таблице 2, были получены с помощью косвенных оценок, на основании работ [72, 82]. Чтобы описать активацию II и mIIa протромбиназой, мы использовали схему Рис. 3.


Рис. 3. Активация фактора II протромбиназой


Реакция требует двух последовательных расщеплений молекулы фактора II, при этом может образовываться промежуточный продукт, мезотромбин, где Е означает комплекс Xa-Va. На ее основании стандартным образом, как при выводе формул кинетики Михаэлиса-Ментен, были получены использованные в модели формулы


(38)

(39)

(40)


Реакции активации и инактивации кофакторов, факторов VIII и V.

. Активация факторов V и VIII.

Для описания активации факторов V и VIII тромбином использовались константы (см. Таблицу 2), взятые из экспериментальных работ. Константы для фактора VIII были получены на свиных белках. Поскольку активация свиного фактора VIII включает расщепление трех пептидных связей, для описания реакции в целом были взяты константы для наиболее медленной стадии. Активация фактора V мезотромбином считалась протекающей в 5 раз быстрее, чем активация тромбином на основании [81]. Данных по активации фактора VIII мезотромбином не было обнаружено, но в силу гомологичности факторов VIII и V в модели предполагалось, что она протекает с той же скоростью, что и активация тромбином.

. Инактивация фактора VIII.

Известно, что фактор VIII быстро инактивируется в плазме, предположительно, за счет диссоциации на субъединицы. Константа его инактивации была взята из работы [63].

Сборка мембранных комплексов внутренней теназы и протромбиназы.

Реакции сборки ферментативных комплексов протекают в несколько этапов. Компоненты комплекса должны сесть на мембрану и провзаимодействовать на ней. При этом, по-видимому, лимитирующей по скорости стадией является стадия посадки на мембрану [49]. Однако, поскольку большая часть факторов свертывания постоянно связана с мембраной, для скорости сборки комплекса протромбиназы константа ассоциации факторов Xa и Va была оценена по данным [49] для константы ассоциации на поверхности мембраны, а константа обратной реакции была рассчитана из равновесной константы диссоциации.

Для похожего во многих отношениях на протромбиназу комплекса внутренней теназы кинетических констант в литературе обнаружено не было, а наблюдаемая равновесная константа диссоциации близка к равновесной константе диссоциации протромбиназы (см. Таблицу 2). Поэтому для ассоциации факторов VIIIa и IXa были выбраны те же значения кинетических параметров, что и для Xa и Va.

Путь PCa

Для активации протеина С тромбином использовались кинетические константы, определенные в эксперименте [32]. Для мезотромбина были использованы те же константы, на основании того, что каталитическая активность мезотромбина по отношению к протеину С совпадает с активностью тромбина [30].

Антитромбин.

Антитромбин - стехиометрический ингибитор сериновых протеаз, один из важнейших регуляторов системы свертывания. Он ингибирует факторы Xa, IXa, IIa, mIIa путем образования комплекса 1:1, который диссоциирует медленно, поэтому связывание считалось необратимым. Константы образования комплекса были взяты из экспериментальных работ (см. Таблицу 2).

Путь TFPI.

Подробное рассмотрение механизма действия ингибитора пути тканевого фактора проведено в разделе 4.1.


3.2 Математическая модель пространственной динамики свертывания в плазме


При изучении свертывания в цельной крови и плазме модель (9-34) была модифицирована с учетом отличий в биохимии реакций в очищенных в системах и в плазме (см. ниже). Полученная модель состояла из нескольких десятков дифференциальных уравнений. Такая система, давая наиболее адекватное описание, слишком сложна для аналитических и численных исследований, особенно при рассмотрении пространственной задачи типа реакция-диффузия. Поэтому в наших пространственных расчетах использовалась система, полученная из исходной редукцией быстрых (характерное время изменения меньше секунд) и медленных (характерное время изменения больше часа) переменных в соответствии с теоремой Тихонова [6]. Редуцированная система состояла из 16 дифференциальных уравнений. При рассмотрении пространственной задачи это давало 13 дифференциальных уравнений в частных производных (уравнения (44-56) для факторов в объеме плазмы) и 3 обыкновенных дифференциальных уравнения (уравнения (41-43) для поверхностных плотностей факторов на активирующей поверхности). В гомогенном случае, когда диффузией можно пренебречь (уравнения не показаны), численно было показано, что на временах от секунд до часа редуцированная система с точностью до 10% демонстрирует то же поведение, что и нередуцированная. С учетом диффузионных членов редуцированная система в пространстве имеет следующий вид.

Переменные , , описывают кинетику поверхностной плотности факторов свертывания:


(41)

(42)

(43)


Переменные , , , , , , , , , , , , описывают пространственную динамику объемных концентраций факторов свертывания:


(44)

(45)

(46)

(47)

(48)

(49)

(50)

(51)

(52)

(53)

(54)

(55)

(56)


Граничное условие на левой стенке для факторов VIIa, IXa, Xa имели вид:


(57)

(58)

(59)


При рассмотрении свертывания по внутреннему пути условие для фактора XIa имело вид


(60)


где А был обозначен вток фактора XIa с левой стенки. Для остальных факторов на левой стенке и для всех факторов на правой было задано граничное условие непротекания вида:


(61)

(62)


Значения коэффициентов диффузии определялись на основании молекулярных масс веществ и были равны (мм2/мин): VIIa, =0.0037; VII, =0.0037; IXa, =0.0037; Xa, =0.0037; IIa, =0.0028; VIIIa, =0.0023; VIII, =0.0017; Va, =0.0019; V, =0.0015; PCa, =0.0032; XIa, =0.0021. Диффузией фибриногена и фибрина пренебрегали из-за ее медленности.

Активация свертывания по внешнему пути моделировалось появлением тканевого фактора на левой стенке сосуда. Cчиталось, что 1 клетка фибробласта/мм2 соответствует 2.5*10-20 моль тканевого фактора/мм2 [71]. Если не обозначено иное, значения констант реакций соответствовали Таблице 3.


Таблица 3. Кинетические константы реакций системы свертывания, использованные при моделировании свертывания в плазме

КонстантаЗначениеСсылка, 1 нМ-1мин-1, 0.01 мин-1см. текст (раздел 3.1), 1 нМ-1мин-1, 0.01 мин-1см. текст (раздел 3.1), 912 мин-1, 1200 нМ[26], 3.66 мин-1, 2700 нМ[26]770 мин-1см. текст (раздел 4.1),28 мин-1, 210 нМ[21], 25 мин-1, 310 нМ[89], 420 мин-1, 238 нМ[17], 0.79 мин-1, 10110 нМ[70]1740 мин-1, 4000 нМсм. текст (раздел 4.4)4.1 мин-1, 1080 нМ[72]1140 мин-1, 820 нМ[83]54 мин-1, 147 нМ[39]0.31 мин-1[63]14 мин-1, 71.7 нМ[57]1 нМсм. текст (раздел 3.1)1 нМсм. текст (раздел 3.1)1.2 мин-1, 60000 нМ[32]0.1 мин-1[33]1.2 нМ-1 мин-1[80]0.00006 нМ-1мин-1[44]0.0003 нМ-1мин-1[31]0.0004 нМ-1мин-1[41]6 нМ-1мин-1см. текст (раздел 4.1)0.00005 мин-1, 50 нМсм. текст (раздел 4.2)2 мин-1[93]5040 мин-1, 7200 нМ[38]

Рассмотрим наиболее существенные изменения, внесенные в модель, описывающую свертывание в плазме, по сравнению с моделью для реконструированных систем.

Редукция мембранных комплексов

При редукции системы уравнений (9-34) применялись, главным образом, два приема. Во-первых, концентрации ряда предшественников, таких, как факторы IX, X, VII, протеин С, мало изменяющиеся за характерные времена свертывания (менее 10% за час), были положены равными константам. Во-вторых, были редуцированы быстрые переменные, соответствующие концентрациям фермент-субстратных и фермент-продуктных комплексов, таких, как Xa-VIIa-TF, а также комплексов внутренней теназы и протромбиназы (кинетические константы ассоциации/диссоциации этих комплексов приведены в Таблице 2). Важно отметить, что во время свертывания концентрация компонентов последних двух комплексов могут значительно превышать константы их диссоциации. Например, концентрация фактора X достигает 2-3 нМ [43], а фактора Va -10 нМ и более [27] при Kd=1 нМ. В предыдущих моделях при редукции комплексов теназы и протромбиназы использовались формулы


(63)


(в работах [11, 94]) или


(64)


(в работе [45]), где [АВ] - концентрация комплекса, а [А] и [В] - полные концентрации компонент комплекса. По указанным выше причинам такой подход может быть не вполне корректным. Поэтому были использованы обладающие более широким диапазоном применимости формулы [5]:


(65)

(66)


Константы и механизмы реакции образования тромбина

Кинетика активации протромбина на в плазме отличается от кинетики очищенных систем, хотя механизмы этого различия не вполне ясны [82]. В отличие от реакции в очищенных системах (см. раздел 3.1), в плазме эта реакция идет без образования промежуточного продукта мезотромбина [82] и строго подчиняется кинетике Михаэлиса [83]. В недавнем исследовании, однако, было показано, что при свертывании в цельной крови может наблюдаться накопление другого интермедиата реакции, претромбина 2 [27]. Поскольку это вещество не обладает каталитической активностью, можно ожидать, что его наличие не изменит кинетику системы в целом. Поэтому в настоящей работе при моделировании свертывания в плазме и цельной крови реакция считалась проходящей по механизму Михаэлиса, а константы были взяты из экспериментальных данных работы [83].

Реакция образования фибрина

Для описания превращения фибриногена в фибрин использовалась константа, полученная в экспериментальной работе [38]. Поскольку концентрация фибриногена в плазме имеет порядок константы Михаэлиса для этой реакции (см. Таблицы 1 и 3), а продукт реакции, фибрин, связывает тромбин с той же аффинностью, что и фибриноген, то все выражения для реакций с участием тромбина изменились, приобретя члены в знаменателе, описывающие тот факт, что часть тромбина связана с фибрином и фибриногеном. Так, выражение для активации фактора XI приобрело вид:


(67)


вместо


(68)


Активация фактора XI

Исследование влияния реакции активации фактора XI на кинетику свертывания и выбор констант для этой реакции проведены в разделе 4.2.

Прочие изменения, связанные с моделированием свертывания в плазме

Поскольку плазма крови содержит ряд веществ, отсутствовавших в моделируемых очищенных системах, в уравнениях модели появился ряд дополнительных членов. Так, была добавлена реакция ингибирования активированного протеина С ингибитором протеина С [33]. Фактор XIa эффективно ингибируется несколькими ингибиторами плазмы, включая антитромбин III, альфа2-макроглобулин, альфа1-антитрипсин и ингибитор протеина С. Для описания этих реакций была использована суммарная константа псевдопервого порядка для ингибирования фактора XIa в плазме [93]. Еще одно изменение связано с реакцией инактивации фактора Va активированным протеином С. Фактор Va в составе комплекса протромбиназы защищен от расщепления, однако присутствие другого плазменного белка, протеина S, способно снять эту защиты [80]. Поэтому в модели, описывающей свертывание в плазме (41-56), весь пул фактора Va доступен для ингибирования, в отличие от модели для очищенных систем (9-34), где может инактивироваться лишь свободный фактор V.

Сравнение теории и эксперимента

При экспериментальном исследовании пространственной динамики свертывания регистрируемой величиной является интенсивность светорассеяния (Рис. 4А). Результатом моделирования того же процесса является фибрин как функция пространства и времени (Рис. 4Б). Интенсивность светорассеяния и концентрация фибрина связаны, вообще говоря, нелинейно. Кроме того, сопоставление серий кривых не очень удобно. Поэтому при сравнении предсказаний модели и результатов эксперимента производилось сравнение зависимостей размера сгустка от времени (напр., Рис. 12). За размер сгустка в каждый момент времени принималась абсцисса точки на профиле фибрина или интенсивности светорассеяния, ордината которой равнялась половине амплитуды бегущего фронта.


Рис. 4. Пространственная динамика свертывания в норме. Панель А, экспериментальные профили светорассеяния. Панель Б, теоретические профили фибрина. Промежуток времени между профилями составляет 2 минуты. Расчеты производились по модели (41-56), концентрация клеток фибробластов на поверхности активатора была равна 100 кл/мм2. Экспериментальные данные взяты из [5]


Глава 4. Исследование математической модели системы свертывания


.1 Регуляция свертывания ингибитором пути тканевого фактора


С механизмом действия TFPI связаны самые сильные предположения из тех, что были допущены при создании модели. Согласно существующему представлению, TFPI связывает фактор Xa, а затем комплекс Xa-TFPI связывает VIIa-TF, выключая внешний путь. В эксперименте, когда в систему очищенных белков-прокоагулянтов системы свертывания добавляется TFPI, изменение в кинетике системы было очень сильно (Рис. 4). Однако, попытки смоделировать эти результаты с помощью математической модели, использующей описанный выше механизм действия, не увенчались успехом. Теоретическое ингибирование, показанное на Рис. 4, намного меньше экспериментального; фактически, кривые для систем в присутствии и в отсутствие TFPI совпадают.

TFPI - ингибитор типа Кюнитца, содержащий три домена типа Кюнитца [35]. Известно, что первый домен связывает фактор VIIa, а второй - фактор Xa.

Функция третьего домена пока неизвестна [35]. Свободный TFPI связывает VIIa медленно и слабо по сравнению с фактором Xa [23]. Образующийся комплекс Xa-TFPI способен хорошо связывать VIIa-TF, формируя ингибиторный комплекс Xa-TFPI-VIIa-TF. Исходя из этих данных, и был предложен [23] двухшаговый механизм действия TFPI: TFPI сначала связывает Xa, затем комплекс Xa-TFPI связывает VIIa-TF, полностью ингибируя его активность.


Рис. 5. Влияние TFPI на образование тромбина в очищенной системе, содержащей факторы IX, X, VIII, V, II в концентрациях, указанных в Таблице 1. Активация производится 1.25 пМ комплекса VIIa-TF. Концентрация TFPI 2.5 нМ (?) или 0 нМ (?). Экспериментальные данные взяты из работ [87, 88]. Теоретические расчеты (гладкие кривые) произведены по модели (9-34), с тем исключением, что константы , положены нулевыми (то есть работает только классический механизм действия TFPI)


Недавно было показано [18], что общепринятый двухшаговый механизм действия TFPI не может объяснить экспериментальные данные по кинетике ингибирования комплекса VIIa-TF в процессе активации фактора X. Baugh et al. измерили кинетические константы взаимодействия Xa с TFPI и комплекса Xa-TFPI с VIIa-TF. На основании этих данных в той же работе [18] они построили математическую модель активации фактора Х комплексом VIIa-TF и ингибирующего действия TFPI. Поскольку в этом процессе исходно нет активированной формы фактора Х, модель предсказала довольно слабое уменьшение скорости активации фактора X в присутствии TFPI. В эксперименте в этих же условиях авторы работы [18] получили быстрое и полное ингибирование производства фактора Xа. Для объяснения обнаруженного противоречия они предположили, что основным путем ингибирования является путь, где TFPI ингибирует сформировавшийся ранее комплекс Xa-VIIa-TF. Они предложили схему, согласно которой TFPI может связываться с фактором Xa в процессе его образования уже на стадии фермент-продуктного комплекса Ха-VIIa-TF; затем следует внутримолекулярное превращение в ингибиторный комплекс Xa-TFPI-VIIa-TF. Однако, предложенная схема детально исследована не была.

Чтобы описать кинетику свертывания полной системы, нами было проведено дополнительное исследование блока реакций, связанных с активацией фактора X внешней теназой и регуляцией этой реакции ингибитором пути тканевого фактора. Ниже приведена система уравнений для реакций этого блока, предназначенная для подробного описания систем, включающих факторы VIIa-TF, X, Xa и TFPI. Обозначения системы: S, фактор X; E, VIIa-TF; P, фактор Xa; I, TFPI.


(69)

(70)

(71)

(72)

(73)

(74)

(75)

(76)

(77)

(78)


Система уравнений (69-78) выписана в соответствии со схемой Рис. 5, включающей все гипотетические реакции, которые будет обсуждаться ниже.

Критерии выбора величин констант. Значения констант, использованные в расчетах, и источники информации об этих константах суммированы в Таблице 2. Нам не удалось найти информацию о некоторых константах. Обсудим несколько подробнее критерии выбора значений для этих констант.

Реакция активации фактора Х комплексом VIIa-TF рассматривалась, как протекающая по двухшаговой схеме Михаэлиса-Ментен с добавлением стадии фермент-продуктного комплекса. Мы не нашли литературных данных о кинетических константах образования фермент-субстратного комплекса. Если известна кинетическая константа ассоциации , то, исходя из =435 мин-1, =238 нМ, можно найти его константу диссоциации из соотношения:


=


Из того же соотношения следует, что


2 нМ-1мин-1


Варьирование констант (данные не показаны) показало, что для экспериментов с характерными временами порядка секунд и больше, варьирование значения от 2 нМ-1мин-1 до 10 нМ-1мин-1 и выше не влияет на кинетику системы. Поэтому мы положили ее равной =5 нМ-1мин-1, на основании [43] Это приводит к значению


==770 мин-1.


Константы образования фермент-продуктного комплекса Xа-VIIa-TF (,) также не были обнаружены в литературе. Однако, было показано, что фактор Xa, связывается с VIIa-TF со сродством, лишь немного меньшим, нежели фактор X [19]. Это можно считать убедительным свидетельством в пользу того, что Xa образует с VIIa-TF комплекс, очень похожий на комплекс X-VIIa-TF. Поэтому моделирование производилось при значениях констант (,), равных значениям (, ).

Значения констант гипотетических реакций: взаимодействия фермент-продуктного комплекса с TFPI, ассоциации Xa-TFPI и VIIa-TF с образованием промежуточного ингибиторного комплекса, и внутримолекулярной перегруппировки ингибиторного комплекса были подобраны так, чтобы описать результаты экспериментов из работы [18] (См. Рис 6).

Необходимо отметить, что на самом деле константы взаимодействия Xa и TFPI, измеряемые в эксперименте и приведенные в [18], являются не истинными константами а эффективными. Если гипотетический путь, исследуемый в этой модели, существует, то измеренные значения сложным образом зависят от истинных констант взаимодействия Xa, VIIa-TF и TFPI - , , , , и . Например, в первом приближении


=+


Наблюдаемые и невелики. Ввиду этого не будет большой ошибкой считать истинные константы образования конечного комплекса равными наблюдаемым значениям, а константы гипотетических реакций найти отдельно.

Реакция ингибирования X-VIIa-TF комплексом Xa-TFPI была добавлена следующим способом. Мы считали, что Xa-TFPI взаимодействует с фермент-субстратным комплексом X-VIIa-TF, вытесняя субстрат, фактор Х, и образуя промежуточный ингибиторный комплекс TFPI-Xa-VIIa-TF. Предварительные расчеты показали, что константы , , и практически не влияют на кинетику системы. Поэтому мы положили их равными нулю и слагаемые, отвечающие этим реакциям, в систему уравнений не включены.

Результаты исследования модели

На Рис. 5 мы попытались схематически представить возможные молекулярные взаимодействия между всеми участниками процесса. На панели А изображен процесс активации фактора X с учетом стадий фермент-субстратного и фермент-продуктного комплексов, а также общепринятый двух шаговый механизм ингибирования реакции активации. В финальном ингибиторном комплексе фермент Е связан с первым Кюнитц-доменом ингибитора, а продукт реакции Р - со вторым. Двух шаговая схема Рис. 5А предполагает последовательное связывание сначала продукта с ингибитором, а потом продукт-ингибиторного комплекса с ферментом. Дополнение этой схемы в соответствии с гипотезой Baugh et al (Рис. 5Б) приводит к необходимости внутримолекулярной перестройки ингибиторного комплекса. Как видно из Рис. 5B, связывание ингибитора с фермент-продуктным комплексом должно сначала приводить к возникновению промежуточного комплекс (EPI), в котором продукт, связанный с ферментом, связан также со вторым доменом ингибитора. После внутримолекулярной перестройки возникает окончательный ингибиторный комплекс, в котором фермент уже связан с первым доменом ингибитора. Естественно предположить, что третий Кюнитц-домен TFPI ингибитора образует шарнир, который позволяет провести внутримолекулярную перестройку ингибиторного комплекса без диссоциации. Не исключено, что третий домен участвует не только во взаимодействии с ферментом, но также и с поверхностными структурами клеточной мембраны, с которыми связан фермент.


Рис. 6. Схема реакций пути TFPI. Панель А, активация фактора X комплексом VIIa-TF и ингибирование активации по двухшаговому пути. Панель Б, механизм ингибирования, предложенный в работе [18]. Панель В, дополнительный путь ингибирования фермент-субстратного комплекса комплексом Xa-TFPI. Обозначения: S, фактор X; E, VIIa-TF; P, фактор Xa; I, TFPI.


Математическое моделирование показало, что гипотеза Baugh et al позволяет описать ряд экспериментальных данных (Рис. 6А), которые невозможно было описать с помощью двухшаговой модели. Однако, и эта гипотеза описывает не все экспериментальные данные, в первую очередь, эксперименты по активации фактора X в присутствии преформированного комплекса Xa-TFPI (Рис. 6Б).


Рис. 7. Теоретическое описание эксперимента по ингибированию активации фактора X с помощью гипотезы об ингибировании Xa-VIIa-TF при участии TFPI. Панель A, кривые активации 170 нМ фактора X комплексом VIIa-TF (1024, 512, 384, 256, 192, 128, 64, 32 пМ сверху вниз), в присутствии 2.4 нМ TFPI. Панель Б, кривые активации 170 нМ фактора X комплексом 128 пМ VIIa-TF в присутствии 2.4 нМ TFPI преинкубированного с фактором Xa в концентрации: 1) 0, 2) 0.25, 3) 0.5 и 4) 1 нМ. Теоретические кривые проведены путем численного интегрирования системы (69-78). Значения констант =10 нМ-1 мин-1, =0 мин-1. Все остальные константы соответствуют Таблице 2. Экспериментальные данные взяты из Fig 2 работы [18]


Расхождение можно снять, дополнив гипотезу Baugh et al предположением, что существует взаимодействие Xa-TFPI с фермент-субстратным комплексом X-VIIa-TF или фермент-продуктным Xa-VIIa-TF. Учитывая вероятное сильное сходство между этими комплексами, можно предположить, что Xa-TFPI взаимодействует с обоими. Из Рис. 5В, иллюстрирующего нашу гипотезу, видно, что если комплекс продукта с ингибитором (но не сам ингибитор) вытесняет субстрат с фермента, то это может либо приводить к возникновению промежуточного ингибиторного комплекса, такого же, как тот, что возникает при связывании ингибитора с фермент-продуктным комплексом в гипотезе Baugh et al, либо реакция может сразу идти в конечный ингибиторный комплекс. Модель показывает, что введение взаимодействия Xa-TFPI с фермент-субстратным либо фермент-продуктным комплексами может описать эксперимент (Рис 5А, Б). Наиболее вероятен вариант ингибирования фермент-субстратного комплекса в силу более реалистичных значений получаемых констант. Следует отметить, что из-за малой скорости сборки комплекса Xa-TFPI можно ожидать, что роль этой реакции при физиологических условиях меньше, чем реакции ингибирования Xa-VIIa-TF при участии TFPI. Это подтверждается результатами моделирования систем очищенных белков, имитирующих систему свертывания (Рис. 9).


Рис. 8 Теоретическое описание эксперимента по ингибированию активации фактора X с помощью гипотезы о связывании X-VIIa-TF c Xa-TFPI. Панель А, кривые активации 170 нМ фактора X комплексом VIIa-TF (1024, 512, 384, 256, 192, 128, 64, 32 пМ сверху вниз) в присутствии 2.4 нМ TFPI. панель Б, кривые активации 170 нМ фактора X комплексом 128 пМ VIIa-TF в присутствии 2.4 нМ TFPI преинкубированной с фактором Xa (0, 0.25, 0.5, 1 нМ сверху вниз). Теоретические кривые проведены путем численного интегрирования системы (69-78). Все константы соответствуют Таблице 2. Экспериментальные данные взяты из Fig 2 работы [18]


Рис. 9. Проверка гипотез механизма действия TFPI. Панель А, проверка гипотезы об ингибировании фермент-субстратного комплекса при участии TFPI. Проводилось ингибирование фактора Xa в присутствии и в отсутствие VIIa-TF. Концентрации реагентов: Xa=1 нM, TFPI=1 нM, VIIa-TF=0 или 5 нM. Сверху вниз: кривая в отсутствие VIIa-TF; кривая с VIIa-TF, если реакции нет; кривая с VIIa-TF, если реакция есть. Все константы соответствуют Таблице 2. Панель Б, проверка гипотезы об ингибировании фермент-продуктного комплекса при участии Xa-TFPI. Проводилось ингибирование VIIa-TF комплексом TFPI-Xa в присутствии и в отсутствие Xa. Концентрации реагентов: TF=1 нM, TFPI-Xa=1 нM, Xa=0 или 100 нM. Сверху вниз: кривая в отсутствие Xa; кривая с Xa, если реакции нет; кривая с Xa, если реакция есть. Кривые проведены численным моделирование системы уравнений (69-78) с одним изменением: считалось, что Xa-TFPI ингибирует не X-VIIa-TFPI, а Xa-VIIa-TFPI. Все константы соответствуют Таблице 2


В целом, рассмотренные в гипотезы механизма действия TFPI дают хорошее объяснение известным на настоящий момент экспериментам. Однако, имеющихся данных недостаточно, чтобы сделать выбор между их вариантами и более подробно оценить кинетические параметры этих реакций. Как показывают расчеты, это можно сделать в сравнительно несложных экспериментах (Рис 7А, Б). Используя избыточные концентрации Xa или VIIa-TF, можно создать довольно высокую концентрацию комплекса Xa-VIIa-TF по сравнению с концентрацией свободного лимитирующего компонента. Тогда, при добавлении ингибитора лимитирующего компонента (Xa-TFPI или TFPI, соответственно) скорость реакции ингибирования лимитирующего компонента заметно увеличится по сравнению со скоростью, наблюдаемой в отсутствие избыточного компонента.

Кинетические константы гипотетических реакций ингибирования, найденные с помощью варьирования (Рис. 7А, Б), были использованы для описания кинетики реконструированных систем. На Рис. 9 показано, что с помощью этих констант можно успешно описать влияние TFPI на эти системы.


Рис. 10. Влияние TFPI на образование тромбина в очищенной системе, содержащей факторы IX, X, VIII, V, II в концентрациях, указанных в Таблице 1. Активация производится 1.25 пМ комплекса VIIa-TF. Концентрация TFPI 2.5 нМ (?) или 0 нМ (?). Экспериментальные данные взяты из работ [87, 88]. Теоретические расчеты (гладкие кривые) произведены по модели (9-34).


4.2 Реакция активации фактора XI тромбином


Фактор XI входит в ту ветвь каскада свертывания, которая традиционно называется внутренним путем. При контакте с чужеродной поверхностью фактор XIIa активирует фактор XI, который, в свою очередь, активирует фактор IX. Таким образом, при контактной активации фактор XI является необходимым звеном в цепи реакций.

Однако, как было отмечено выше (см. раздел 1.1), на сегодняшний день общепринятым является мнение, что in vivo значимым является только внешний путь активации свертывания, при котором напрямую активируется фактор X. Тем не менее, в клинике дефицит фактора XI связан со склонностью к кровотечениям, болезнью, называемой гемофилией С [3]. Это заболевание является более легким, чем гемофилии А и Б, связанные с дефицитом факторов VIII и IX, соответственно. При нем опасные кровотечения возникают лишь при глубоких ранениях или при хирургическом вмешательстве [27]. Все же, связь дефицита фактора XI с геморрагией показывает, что фактор XI играет важную, хотя и не критическую роль в гемостазе. Открытие в начале 90-х годов XX века реакции активации фактора XI тромбином послужило причиной возникновения оживленной дискуссии. Как будто бы, эта реакция вполне была способна объяснить описанное разногласие между биохимией свертывания и его клинической картиной. В ранней работе [34] было показано, что в растворе тромбин способен активировать фактор XI в медленной реакции с =0.0078 мин-1, =50 нМ. В присутствии отрицательно заряженных поверхностей типа декстран сульфата скорость этой реакции на порядки возрастала, что дало авторам основание предположить, что похожий механизм ускорения может работать in vivo, и реакция может быть физиологически значимой. С другой стороны, в работе [74] было показано, что присутствие плазменных концентраций фибриногена почти полностью блокирует реакцию в присутствии декстран сульфата, что было интерпретировано, как свидетельство в пользу неэффективности этой реакции. В работе [94], посвященной математическому моделированию пространственной динамики роста тромба, было исследовано влияние этой реакции на рост сгустка и показано, что даже при малых скоростях эта реакция может оказывать сильнейшее влияние на поведение тромба вдали от активатора, там, где она является единственным источником фактора XIa и, следовательно, IXa. В недавних работах [14, 64] исследовалась влияние тромбоцитов на эту реакцию. В работе [14] 1.25 нМ тромбина за 2 минуты практически полностью активировали 60 нМ фактора XI, фибриноген не оказывал на скорость реакции влияния. В работе [64] в полностью идентичных условиях, напротив, 100 нМ тромбина за 30 минут активировали 30 нМ фактора XI лишь на несколько процентов, что соответствует разнице в каталитической эффективности по сравнению с работой [14] на 4 порядка.

Перечисленные сильнейшие противоречия в результатах экспериментальных исследований этой реакции послужили причиной проведения в настоящей работе отдельного исследования роли этой реакции и определения скорости ее протекания в плазме. С этой целью была проведена оценка значений констант активации фактора XI в эксперименте в цельной крови в гомогенной постановке. Если подставить в уравнения значения, полученные в очищенных системах в работе [34], то отличие между нормой и гемофилией С, если судить по кинетике тромбин-антиромбинового комплекса, будет сильно выражено (Рис. 10). Однако, в эксперименте эти два случая практически неразличимы. Это показывает, что константы, измеренные в очищенных системах, на порядки превышают те, что существуют в крови.


Рис. 11. Кинетика тромбин-антитромбинового комплекса при активации цельной крови добавлением 25 пМ тканевого фактора, эксперимент и теория. Свертывание в норме (?, сплошные линии) и при гемофилии С (?, пунктир). Расчеты проведены по гомогенному варианту модели (41-56). Экспериментальные данные взяты из работы [27]


Для более точной оценки кинетической константы активации фактора XI были использованы результаты опытов по росту тромба в цельной крови. На Рис. 11 изображены зависимости размера сгустка от времени при различных значениях каталитической константы активации тромбина. Видно, что наилучшее описание достигается при значении 0.00005 мин-1.


Рис. 12. Теоретическая зависимость размера сгустка от времени при различных концентрациях фактора XI. Каталитическая константа активации фактора XI (сверху вниз): 0.0001, 0.00005, 0.000025, 0.0000125, 0.00000625, 0.000003125, 0.0000005, 0 мин-1. Все остальные константы соответствуют Таблице 2. Расчет проводился по модели (41-56). Концентрация клеток фибробластов на поверхности активатора была равна 100 кл/мм2. Экспериментальные данные (?) взяты из [5]


4.3 Влияние тромбоцитов и фосфолипидов на скорость реакций свертывания


Как упоминалось выше (раздел 1.1), для прохождения почти всех реакций свертывания необходимо наличие фосфолипидных мембран. Известно, что существует три механизма, с помощью которых скорость реакции на мембране может увеличиваться [98]:

. Ориентация молекул, сидящих на мембране, может приводить к тому, что большее число столкновений окажутся результативными.

. Эффект "сгущения" реагентов из объема в тонкий слой, прилегающий к поверхности мембраны [61].

. Большая эффективность двухмерной диффузии по сравнению с трехмерной (так называемая "редукция размерности").

Эти механизмы приводят к увеличению скоростей мембранно-связанных реакций на порядки при добавлении в систему фосфолипидных поверхностей. При этом кинетические параметры таких реакций зависят от концентрации добавленных поверхностей. При построении модели возникает проблема: как быть, если значения констант определялись при одной концентрации фосфолипидов, а моделируемый эксперимент проводится при другой?

Пусть у нас есть реакция, в которой и фермент, и субстрат связаны с поверхностью искусственных фосфолипидов (например, активация протромбина протромбиназой (или фактором Xa) или активация фактора X внутренней теназой (или фактором IXa)). Пусть SB и EB - концентрации связанных реагентов по отношению к всему реакционному объему V. Если реакция связывания быстрая, то эти величины будут зависеть от полных концентраций по закону вида


(79)


где [PCPS] - концентрация фосфолипидов, SE - стехиометрия связывания, Kd - константа диссоциации. Пусть Ssh и Esh - их концентрации в тонком примембранном слое, суммарный объем которого - Vsh. Очевидно,


(80)

(81)


Внутри оболочки реакцию считаем подчиняющейся кинетике Михаэлиса-Ментен. Скорость увеличения концентрации продукта в оболочке


(82)

Увеличение объемной концентрации при этом


= (83)


Отсюда получаем, что наблюдаемая константа Михаэлиса для такой системы пропорциональна концентрации фосфолипидов, [PCPS], а каталитическая константа от нее не зависит, результат, хорошо согласующийся с экспериментальными данными для упомянутых выше белков [72, 84, 70]. В случае, если фермент представляет собой комплекс, например, протромбиназы, концентрация его равна:


(84)


В литературе есть экспериментальные данные по человеческой теназе только для [PCPS]=25 мкМ. В моделируемых нами экспериментах [PCPS]=200 мкМ, на порядок больше. На этом основании мы увеличили константу Михаэлиса с 190 до 4000 нМ, используя для верификации Рис. 12.


Рис. 13. Образование фактора Xa в очищенной системе, содержащей факторы IX, X, VIII, V, II в концентрациях, указанных в Таблице 1. Активация производится 1.25 пМ комплекса VIIa-TF. Экспериментальные данные (?) взяты из работы [87]. Теоретические расчеты (гладкие кривые) произведены по модели (9-34). Константа Михаэлиса для активации фактора X внутренней теназой равна 190 нМ (пунктир) или 4000 нМ (сплошная линия). Все остальные константы соответствуют Таблице 2


Рассмотрим аналогичную задачу для реакции протромбиназы, протекающей на тромбоцитах. В отличие от искусственной поверхности, на тромбоцитах сначала связывается фактор Va, а затем с ним связывается фактор Xa [83]. Концентрация связанного с мембраной фактора Va есть


(85)


где - концентрация специфичных сайтов, - константа диссоциации. Концентрация протромбиназы определяется аналогичной формулой для Xa, только вместо числа сайтов подставляется концентрация связанного Va:


(86)

Для скорости активации протромбина имеем:


v== = (87)


.4 Влияние кинетических констант реакций свертывания на кинетику системы


Естественный вопрос, возникающий при построении модели, связан с зависимостью результатов моделирования от параметров системы. Он имеет два аспекта: во-первых, ответ на него позволяет глубже понять объект, оценить роль отдельных параметров в функционировании системы; во-вторых, подобное исследование помогает оценить устойчивость модели по отношению к варьированию параметров и необходимость дополнительного исследования наиболее важных из них.


Рис. 14. Зависимость лаг-фазы (панель А) и максимальной скорости производства тромбина (панель Б) в очищенных системах от концентрации активатора. Система содержит факторы IX, X, VIII, V, II в концентрациях, указанных в Таблице 1


Активация производится комплексом VIIa-TF, концентрации указаны на рисунке. Экспериментальные данные (?) взяты из работы [88]. Теоретические расчеты (гладкие кривые) произведены по модели (9-34). Константы реакций соответствуют Таблице 2. Все графики кинетики тромбина в реконструированных системах в отсутствие ингибиторов имеют один и тот же вид: лаг-фаза, когда тромбин заметно не нарабатывается, быстрый разгон, почти линейный рост, торможение, плато. Используя эту однородность, можно попробовать выделить несколько параметров, характеризующих график. В работе [88] вводятся два таких параметра: лаг-фаза и угол наклона псевдолинейного участка графика (максимальная скорость производства тромбина). Можно предложить следующий способ формализации данных параметров: псевдолинейная часть по своей сути есть область точки перегиба графика. Максимальная скорость производства тромбина - это значение первой производной в этой точке. Если провести через нее прямую с наклоном, равным этой первой производной, эта прямая пересечет ось времени в точке, соответствующей лаг-фазе. На Рис. 13 приведены экспериментальные и теоретические зависимости лаг-фазы и максимальной скорости производства тромбина от концентрации активатора. Интересно отметить, что в двойных логарифмических координатах зависимости становятся линейными. Представляется интересным вопрос о влиянии различных кинетических констант реакций на форму зависимости концентрации тромбина от времени. Введение двух параметров, вполне характеризующих форму этой кривой, позволило свести все результаты этого исследования в 2 небольшие таблицы. Каждая из каталитических констант реакций, входящих в полную прокоагулянтную систему без ингибиторов, увеличивалась и уменьшалась в 2 и в 10 раз. В левом столбце таблицы стоят названия констант, которые менялись. В остальных - изменение лаг-фаза и угла наклона линейного участка в процентах.


Таблица 4. Зависимость лаг-фазы от кинетических констант модели

Константа1/221/101016.8-18.556.8-60.17.4-8.315.1-25.7 1.1-1.13.6-3.618.8-12.691.7-23.61.2-1.23.8-4.53.7-3.113.6-8.00.5-0.70.7-3.52.4-2.16.9-5.97.4-8.315.1-25.6Таблица 5. Зависимость максимальной скорости производства тромбина от кинетических констант модели

Константа1/221/10101.42.111.140.9-22.331.1-50.21540.4-0.41.4-1.4-23.327.5-61.2101.60.5-0.51.5-1.81.5-1.25.43.30.16-0.30.3-1.30.8-0.82.2-2.3-22.330.9-50.2152

Из этих цифр можно заключить, что:

1. Константы и оказывают совершенно одинаковое влияние на форму кривой тромбина. Это является следствием того, что фактор IXa является лимитирующим компонентом теназы. Видно, что константа , при своем настоящем значении, оказывает очень слабое влияние на форму кривой, - несколько более сильное.

. Как и следовало ожидать, очень сильно влияние константы протромбиназы .

. Прокоагулянтные константы , , при увеличении уменьшают максимальную скорость производства тромбина.

. Изменение констант , , почти одинаково влияет на максимальную скорость.

Обсуждение результатов

В работе построена количественная математическая модель системы свертывания крови. В отличие от предыдущих моделей [4, 67, 43, 46, 50, 51, 91, 94], она способна количественно описывать широкий класс экспериментальных систем: реконструированные системы очищенных факторов свертывания, имитирующие плазму [43, 87, 88], свертывание в цельной крови [27], рост сгустка в пространстве при активации по внешнему и внутреннему пути [5].

С помощью модели было показано, что классический двух шаговый механизм действия TFPI, при котором TFPI сначала связывает фактор Xa, а потом комплекс VIIa-TF, слишком слаб и не может описать эксперимент; в случае, если бы этот механизм был единственным, добавление TFPI к реакционной смеси не повлекло бы за собой заметных изменений в поведении системы (Рис. 4). Гипотетический альтернативный механизм [18], согласно которому TFPI напрямую ингибирует фермент-продуктный комплекс Xa-VIIa-TF, также давал результаты, качественно расходящиеся с экспериментом (Рис. 6). Однако, если дополнить его гипотезой об ингибировании фермент-субстратного комплекса X-VIIa-TF комплексом Xa-TFPI, получившаяся модель успешно описывает экспериментально наблюдаемые зависимости (Рис. 7, Рис. 9). Разумеется, конечное суждение об устройстве блока реакций TFPI может вынести только эксперимент. Наиболее простым экспериментом, в котором может быть подтверждено или опровергнуто существование этих реакций, может быть постановка, в которой концентрация фермент-продуктного или фермент-субстратного комплекса искусственно увеличена: при избытке одного из компонентов комплекса второй будет почти целиком входить в него. В результате, реакции, идущие через комплекс, станут намного эффективнее и будут хорошо заметны (Рис. 8).

Был проведен анализ влияния реакции активации фактора XI тромбином на свертывание. Результаты показали, что, если эта реакция в плазме идет с такой же скоростью, что и в очищенных системах, то как в гомогенной, так и в пространственной постановке модель качественно не может описать эксперимент. Поскольку фактор XI находится на самой вершине усилительного каскада, положительная обратная связь даже при малых скоростях реакции оказывается очень сильной. Для того, чтобы успешно описать эксперимент, эффективность реакции должна быть уменьшена на два порядка. Механизм такого уменьшения остается за рамками данного исследования. Наиболее вероятно, что оно связано с оккупацией тромбина многочисленными субстратами в плазме, которое, возможно, не всегда можно учесть с помощью простой формулы (8). Вполне возможна аллостерическая регуляция активности тромбина. Также возможно, что скорость реакции регулируется изменениями, связанными с субстратом, фактором XI. Необходимо подчеркнуть, что до сих пор дискуссия в литературе велась вокруг поиска доказательств заметности столь слабой реакции в плазме [34, 74], в то время как данные настоящей работы поднимают вопрос о том, что скорость реакции в очищенных системах, в отсутствие всяких кофакторов, наоборот, на два порядка выше, чем требует описание экспериментов в плазме.

Была исследована зависимость кинетики производства тромбина в реконструированных системах от кинетических констант реакций, входящих в каскад. Основным результатом явилась очень высокая устойчивость системы по отношению к возмущениям констант реакций. При десятикратном их варьировании только и меняли лаг-фазу больше, чем на 20-25%. На максимальную скорость тромбина эффект, больший 25%, оказывали они же и и . Ни одна из констант при 10-кратном изменении не меняла лаг-фазу или скорость более чем вдвое. Эти данные свидетельствуют в пользу достаточной устойчивости модели: ошибки в экспериментах по определению констант сравнительно слабо сказываются на ответе системы в целом. С другой стороны, это говорит о устойчивости моделируемой системы, что физиологически выглядит вполне разумно: неконтролируемое свертывание может представлять смертельную опасность для организма. Интересно также, что константы и оказывают совершенно одинаковое влияние на форму кривой тромбина, что можно интерпретировать, как результат того, что фактор IXa является лимитирующим компонентом теназы.

Модель была предназначена для моделирования систем, содержащих в качестве прокоагулянтной поверхности 200 мкМ искусственных фосфолипидов или же тромбоциты (тромбоцитарные микровезикулы) в концентрациях, близких к нормальной. Одним из дальнейших направлений исследования является включение в нее концентрации поверхности любого типа как переменной величины. Шагом в этом направлении было выведение формул зависимости скоростей реакций теназы и протромбиназы от концентрации тромбоцитов и фосфолипидов.

На настоящий момент модель может успешно применяться для планирования разнообразных экспериментов, предсказания и объяснения их результатов. Однако, хотя результаты опытов in vitro, особенно экспериментов по пространственному росту тромба, хорошо корреллируют с наблюдающейся клинической картиной, модель в перспективе может позволить описание ситуации in vivo, что является перспективой этих исследований. Первыми шагами в этом направлении должны быть введение в модель механизма активации и агрегации тромбоцитов, а также потока, который служив важным формообразующим элементом в формировании тромбоцитарного сгустка.


Выводы


. Проведен анализ литературы и построена модель системы свертывания, количественно описывающая эксперименты по исследованию: 1) реконструированных систем очищенных белков, имитирующих систему свертывания; 2) цельной крови; 3) пространственного роста сгустка в плазме.

.Показано, что общепринятый двух шаговый механизм действия TFPI слишком слаб и не может описать экспериментальные данные по активации фактора X внешней теназой в присутствии TFPI. Показано, что введение двух реакций, ингибирования фермент-продуктного комплекса Xa-VIIa-TF при участии TFPI и ингибирования комплекса Xa-VIIa-TF или X-VIIa-TF с помощью Xa-TFPI, позволяет описать все существующие экспериментальные данные единым набором констант. Предложена постановка эксперимента для проверки этой гипотезы.

. Показано, что реакция активации фактора XI влияет на поведение системы в пространстве вдали (1 мм) от активатора. Показано, что эффективность этой реакции в плазме должна быть значительно ниже (не менее 2 порядков), чем в очищенных системах, чтобы описать существующие экспериментальные данные.

. Получены формулы для зависимости скорости реакций внутренней теназы и протромбиназы от концентрации искусственных фосфолипидных поверхностей и тромбоцитов.

. Исследована зависимость кинетики системы от констант реакций в случае очищенных систем и показано, что: а) система устойчива по отношению к сильным изменениям констант; б) наиболее сильно воздействуют на систему константы работы внешней и внутренней теназ и протромбиназы; в) при это реакции активации фактора IX внешней теназой и фактора X внутренней теназой оказывают совершенно одинаковое воздействие на кинетику системы.

Список сокращений


АДФ - аденозиндифосфорная кислота.

a0, АТ-III - антитромбин III.

HK - высокомолекулярный кининоген.

i0, I, TFPI - ингибитор пути тканевого фактора.

К - калликреин.

mIIa - мезотромбин.

PK - прекалликреин.

, E - комплекс VIIa-TF.

- комплекс VII-TF.

, TF - тканевый фактор.

- фибрин.

- фактор IIa.

- фактор Va.

- фактор VIIa.

- фактор VIIIa.

- фактор IXa.

, P - фактор Xa.

- фактор XIa.

, PCa - активированный протеин С.

- фибриноген.

- фибриноген, средняя плазменная концентрация.

- фактор II.

- фактор II, средняя плазменная концентрация.

- фактор V.

- фактор V, средняя плазменная концентрация.

- фактор VII, средняя плазменная концентрация.

- фактор VIII.

- фактор VIII, средняя плазменная концентрация.

- фактор IX, средняя плазменная концентрация.

, S - фактор Xa.

-фактор X, средняя плазменная концентрация

- фактор XI, средняя плазменная концентрация.

, PC - протеин С, средняя плазменная концентрация.


Список использованной литературы


1. Атауллаханов Ф.И., Гурия Г.Т., Сафрошкина А.И. (1994) Пространственные аспекты динамики свертывания крови. II. Феноменологическая модель. Биофизика, т. 39, стр. 97-106.

. Барынин И.А., Старков И.А., Ханин М.А. (1999) Математические модели в физиологии гемостаза. Известия Академии наук, н. 1, стр. 59-66.

. Исследование системы крови в клинической практике, М., "Триада-Х", 1998.

. Козлов А.А., Берковский А.Л., Качалова Н.Д., Простакова Т.М. Пособие для врачей-лаборантов по методам исследования гемостаза. М., ГНЦ РАМН, 2001.

. Пантелеев М.А., Зарницына В.И, Морозова О.Л., Лобанов А.И., Ованесов М.В., Коротина Н.Г., Лобанова Н.С., Атауллаханов Ф.И. (2001) Математическое моделирование пространственно-временной динамики свертывания крови, Труды Международной конференции "Параллельные вычисления и задачи управления". т. 6, стр. 54-78.

. Тихонов А.Н., Васильева А.Б., Свешников А.Г., Дифференциальные уравнения. М., Наука, 1998.

. Физиология человека (том 2), под редакцией Р. Шмидта и Г. Тевса, М, Мир, 1996.

. Хайрер Э., Нерсетт С., Ваннер Г., Решение обыкновенных дифференциальных уравнений. Нежесткие задачи. М. Мир, 1990.

. Ahmad S.S., Scandura J.M, Walsh P.N. (2000) Structural and functional characterization of platelet receptor-mediated factor VIII Binding, J. Biol. Chem, vol. 275, pp. 13071-13081.

. Andrews D.A., Low P.S. (1999) Role of red blood cells in thrombosis. Curr. Opin. Hematol. vol. 6, pp. 76-82.

. Ataullakhanov F.I., Molchanova D.A., Pokhilko A.V. (1995), A simulated mathematical model of the blood coagulation system intrinsic pathway, Biophysics, vol. 40, pp. 413-421.

. Bach R., Gentry R., Nemerson Y. (1986) Factor VII binding to tissue factor in reconstituted phospholipid vesicles: induction of cooperativity by phosphatidylserine. Biochemistry, vol. 25, pp. 4007-4020.

. Baglia F.A., Walsh P.N. (2000 ) Thrombin-mediated feedback activation of factor XI on the activated plateletsurface is preferred over contact activation by factor XIIa or factor XIa. J. Biol. Chem., vol. 275, pp. 20514-20519.

14. Baglia F.A., Walsh P.N. (1998) Prothrombin is a cofactor for the binding of factor XI to the platelet surface and for platelet-mediated factor XI activation by thrombin, Biochemistry, vol. 37, 2271-2281.

. Bajaj M.S., Birktoft J.J., Steer S. A., Bajaj S.P. (2001) Structure and biology of tissue factor pathway inhibitor . Thromb. Haemost., vol. 86, pp. 959-72.

. Bajaj S.P., Rapaport S.I. Russel W.A. (1983) Determination of the rate limiting step in the activation of factor IX by factor XIa and by factor VIIa/tissue factor. Explanation for different electroforetic radioactivity profiles obtained on activation of 3H- and 125I-labelled factor IX. Biochemistry, vol. 22, pp. 4047-53.

. Baugh R.J., Krishnaswamy S. (1996) Role of the activation peptide in human factor X activation by the extrinsic tenase complex, J. Biol. Chem., vol. 271, pp. 16126-16134.

. Baugh R.J., George J.B., Krishnaswamy S. (1998) Regulation of extrinsic pathway factor Xa formation by tissue factor pathway inhibitor, J. Biol. Chem., v. 273, pp. 4378-4382.

. Baugh R.J., Dickinson C.D., Ruf W., Krishnaswamy S. (2000) Exosite interactions determibe the affinity of factor X for the extrinsic Xase complex. J. Biol. Chem., v. 275, pp. 28826-28833.

. Beltrami E., Jesty J. (1995) Mathematical analysis of activation thresholds in enzyme-catalyzed positive feedbacks: application to the feedbacks of blood coagulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 92, pp. 8744-8748.

. Bom V.J.J., Bertina R.M. (1990) The contribution of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood coagulation factor X by activated factor VII. Biochemical Journal, vol. 265, pp. 327-336.

. Broze G.J.Jr., Girard T.J., Novotny W.F. (1990) Regulation of coagulation by a multivalent Kunitz-type inhibitor, Biochemistry, vol. 29, pp. 7539-7546.

. Broze G.J.Jr., Warren L.A., Novotny W.F., Higuchi D.A., Girard J.J., Miletich J.P. (1988) The lipoprotein-associated coagulation inhibitor that inhibits the factor VII-tissue factor complex also inhibits factor Xa: insight into its possible mechanism of action. Blood, vol. 71, pp. 335-343, 1988.

. Brummel K.E., Butenas S., Mann K.G. (1999) An integrated study of fibrinogen during blood coagulation. J. Biol. Chem., vol. 274, pp. 22862-22870.

. Butenas S; van 't Veer C; Mann KG. (1997) Evaluation of the initiation phase of blood coagulation using ultrasensitive assays for serine proteases. J. Biol. Chem., vol. 272, pp. 21527-21533.

. Butenas S., Mann K.G. (1996) Kinetics of human factor VII activation, Biochemistry, vol. 35, no. 1904-1910.

. Cawthern K.M., van 't Veer C., Lock J.B., DiLorenzo M.E., Branda R.F., Mann K.G. (1998) Blood coagulation in hemophilia A and hemophilia C. Blood, vol. 91, pp. 4581-4592.

. Davie E.W., Ratnoff O.D. (1964) Waterfall sequence for intrinsic blood clotting. Science, vol. 145, 1310-1312.

. Davie E.W., Fujikama K., Kisiel W. (1991) The coagulation cascade: initiation, maintenance, and regulation. Biochemistry, vol. 30, pp. 10363-10370.

. Doyle M.F., Mann K.G. (1990) Multiple active forms of thrombin. IV. Relative activities of meizothrombins. J. Biol. Chem. vol. 265, pp. 10693-10701.

. Ellis V., Scully M.F., Kakkar V.V. (1984) Inhibition of prothrombinase complex by plasma proteinase inhibitors. Biochemistry, vol. 23, pp. 5882-5887.

. Esmon N.L., DeBault L.E., Esmon C.T. (1983) Proteolytic formation and properties of gamma-carboxyglutamic acid-domainless protein C. J Biol Chem., vol. 258, pp. 5548-5553.

. Espana F, Berrettini M., Griffin J.H. (1989) Purification and characterization of plasma protein C inhibitor. Thromb. Res., vol. 55, pp. 369-384.

. Gailani D., Broze G.J.Jr. (1991) Factor XI activation in a revised model of blood coagulation. Science, vol. 253, pp. 909-912.

. Girard T.J., Warren L.A., Novotny W.F., Likert K.M., Brown S.G., Miletich J.P., Broze G.J.Jr. (1989) Functional significance of the Kunitz-type inhibitory domains of lipoprotein-associated coagulation inhibitor. Nature, vol. 338, pp. 518-520.

. Griffin J.H., Fernandez J.A., Deguchi H. (2001) Plasma lipoproteins, hemostasis and thrombosis. Thromb. Haemost. vol. 86, pp. 386-394

. Hemostasis and Thrombosis:Basic Principles and Clinical Practice, edited by Colman R.W., Hirsh J., Marder V.J. and Saltzman E.W. Lippincott Company, Philadelphia, 1994.

. Higgins D.L., Lewis S.D., Shafer J.A. Steady state kinetic parameters for the thrombin-catalyzed conversion of human fibrinogen to fibrin. J. Biol. Chem., vol. 258, pp. 9276-9282.

. Hill-Eubanks D.C., Lollar P. (1990) Von Willebrand factor is acCofactor for thrombin-catalysed cleavage of the factor VIII light chain. J. Biol. Chem., vol. 265, pp. 17854-17858.

. Hirayama H., Yoshii K., Ojima H., Kawai N., Gotoh S. and Fukuyama Y. (1995) IEICE Trans. Fundamentals, vol. E78-A, pp. 1419-1431.

. Jesty J. (1986) The kinetics of inhibition of alpha-thrombin in human plasma. J. Biol. Chem. vol. 261, pp. 10313-10318.

. Jesty J., Wun T.C., Lorenz A. (1994) Kinetics of the inhibition of factor Xa and the tissue factor-factor VIIa complex by the tissue factor pathway inhibitor in the presence and absence of heparin, Biochemistry, vol. 33, pp. 12686-12694.

. Jones C.J., Mann K.G. (1994) A model for the tissue factor pathway to thrombin. II. A mathematical simulation. J. Biol. Chem., vol. 269, pp. 23367-23373.

. Jordan R.E., Oosta G.M., Gardner W.T., Rosenberg R.D. (1980) The kinetics of hemostatic enzyme-antithrombin interactions in the presence of low molecular weight heparin. J. Biol. Chem. vol. 255, pp. 10081-10090

. Khanin M.A., Semenov V.V., (1989) A mathematical model of the kinetics of blood coagulation. J. Theor. Biol., vol. 136, pp. 127-134.

. Khanin M.A., Rakov D.V., Kogan A.E. (1998) Mathematical model for the blood coagulation prothrombin time test. Thromb. Res., vol. 89, pp. 227-232.

. Komiyama Y., Pedersen A.H., Kisiel W. (1990) Proteolytic activation of human factors IX and X by recombinant human factor VIIa: effects of calcium, phospholipids, and tissue factor. Biochemistry, vol. 29, pp. 9418-9425.

. Krishnaswamy S. (1992) The interaction of human factor VIIa with tissue factor. J. Biol. Chem. vol. 267, pp. 23696-23706.

. Krishnaswamy S., Jones K.C., Mann K.G. (1988) Prothrombinase complex assembly. Kinetic mechanism of enzyme assembly on phospholipid vesicles. J. Biol. Chem., vol. 263, pp. 3823-3834.

. Kuharsky A.L., Fogelson A.L. (2001) Surface-mediated control of blood coagulation: the role of binding site densities and platelet deposition. Biophys J., vol. 80, pp. 1050-1074.

. Leipold R.J., Bozarth T.A., Racanelli A.L., Dicker I.B. (1995) Mathematical model of serine protease inhibition in the tissue factor pathway to thrombin. J. Biol. Chem., vol. 270, pp. 25383-25387.

. Levin S.N. (1966) Enzyme amplifier kinetics. Science, vol. 152, pp. 651-653.

. Lollar P., Knutson G.J., Fass D.N. (1985) Activation of porcine factor VIII:C by thrombin and factor Xa. Biochemistry, vol. 24, pp. 8056-8064.

. Macfarlane R.G. (1964) An enzyme cascade in the blood clotting mechanism, and its function as a biochemical amplifier, Nature, vol. 202, pp. 498-499.

. Mann K.G. (1999) Biochemistry and physiology of blood coagulation. Thromb. Haemost., vol. 82, pp. 165-174.

. Martorana F. and Moro A. (1974) On the kinetics of enzyme amplifier systems with negative feedbacks, Math. Biosci., vol. 21, pp. 77-84.

. Monkovic D.D., Tracy P.B. (1990) Activation of human factor V by factor Xa and thrombin. Biochemistry, vol. 29, pp. 1118-1128

. Monkovic D.D., Tracy P.B. (1990) Functional characterization of human platelet-released factor V and its activation by factor Xa and thrombin. J. Biol. Chem., vol. 265, pp. 17132-17140.

. Morawitz P. (1905) Die chemie der Blutgerrumung. Ergebn Physiol., vol. 4, pp. 307-423.

. Nesheim M.E., Taswell J.B., Mann K.G. (1979) The contribution of bovine factor V and factor Va to the activity of prothrombinase. J. Biol. Chem., vol. 254, pp. 10952-10962.

. Nesheim M.E., Tracy R.P., Mann K.G. (1984) "Clotspeed," a mathematical simulation of the functional properties of prothrombinase. J. Biol. Chem., vol. 259, pp. 1447-1453.

. Neuenshwander P., Jesty J. (1988) A comparison of phospholipid and platelets in the activation of human factor VIII by thrombin and factor Xa, and in the activation of factor X. Blood, vol. 72, pp. 1761-1770.

. Neuenschwander P.F., Jesty J. (1992) Thrombine-activated and factor Xa-activated human factor VIII: differences in cofactor activity and decay rate. Arch. Bioch. Biophys., vol. 296, pp.426-434.

. Oliver J.A., Monroe D.M, Roberts H.R., Hoffman M. (1999) Thrombin activates factor XI on activated platelets in the absence of factor XII. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., vol. 19, pp. 170-177.

. Peyrou V., Lormeau J.C., Herault J.P., Gaich C., Pfliegger A.M., Herbert J.M. (1999) Contribution of erythrocytes to thrombin generation in whole blood. Thromb. Haemost. vol. 81, pp. 400-406.

. Pokhilko A.V., Ataullakhanov F.I. (1998) Contact activation of blood coagulation: trigger properties and hysteresis. Kinetic recognition of foreign surfaces upon contact activation of blood coagulation: a hypothesis. J. Theor. Biol., vol. 191, pp. 213-219.

. Pohl B., Beringer C., Bomhard M., Keller F. (1994) The quick machine--a mathematical model for the extrinsic activation of coagulation.Haemostasis, vol. 24, pp. 325-337.

. Rao L.V., Rapaport S.I. (1987) Studies of a mechanism inhibiting the initiation of the extrinsic pathway of coagulation. Blood, vol. 69, pp. 645-651.

. Rapaport S.I. (1991) The extrinsic pathway inhibitor: a regulator of tissue factor-dependent blood coagulation, Thromb. Haemostasis, vol. 66, pp.6-15.

. Rawala-Sheikh R., Ahmad S.S., Ashby B., Walsh P.N. (1990) Kinetics of coagulation factor IX activation by platelet-boun factor IXa. Biochemistry, vol. 29, pp. 2606-2611.

. Rodgers G.M., Broze G.J.Jr., Shuman M.A. (1984) The number of receptors for factor VII correlates with the ability of cultured cells to initiate coagulation. Blood, vol. 63, pp. 434-438.

. Rosing J., Tans G., Govers-Riemslag, Zwaal R.F.A., and Hemker H.C. (1980) The role of phospholipids and factor Va in the prothrombinase complex. J. Biol. Chem., vol.255, pp. 274-283.

. Scandura J.M., Ahmad S.S., Walsh P.N. (1996) A binding site expressed on the surface of activated platelets is shared by factor X and prothrombin, Biochemistry, v. 35, pp. 8890-8902.

. Scott C.F. and Colman R.W. (1992) Fibrinogen blocks the autoactivation and thrombin-mediated activation of factor XI on dextran sulfate, Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 89, pp. 11189-11193.

. Schmidt A. (1872) Neue Untersuchungen ueber die Fasserstoffesgerinnung. Pflueger's Arch. Physiol., vol. 6, pp. 413-538.

. Seegers W.H. (1949), Activation of purified prothrombin. Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., vol. 72, pp. 677-680.

. Schoen P., Linhout T (1987) The in situ inhibition of prothrombinase-formed human alpha-thrombin and meizothrombin(des F1) by antithrombin III and heparin. J. Biol. Chem., vol. 262, pp. 11268-11274

79. Solum N.O. (1999) Procoagulant expression in platelets and defects leading to clinical disorders. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., vol. 19, pp. 2841-2846.

. Solymoss S., Tucker M.M., Tracy P.B. (1988) Kinetics of inactivation of membrane-bound factor Va by activated protein C. Protein S modulates factor Xa protection. J. Biol. Chem., vol. 263, pp. 14884-14890.

. Tabs G., Nicolaes G.A.F., Thomassen M.C. L.G.D., Hemker H.C., van Zonneveld A.-J., Pannekoek H., Rosing J. (1994) Activation of human factor V by meizothrombin. J. Biol. Chem., vol. 269, pp. 15969-15972.

. Tans G., Janssen-Claessen K., Hemker H. C., Zwaal R.F.A., Rosing J. (1991) Meizothrombin formation during factor Xa-catalyzed prothrombin activation. J. Biol. Chem., vol. 266, pp. 21864-21880.

. Tracy P.B., Eide L.L., Mann K.G. (1985) Human prothrombinase complex assembly and function on isolated peripheral blood cell populations. J Biol Chem., vol. 260, pp. 2119-2124.

. van Dieijin G., Tans G., Rosing J., Hemker H.C. (1981) The role of phospholipid and factor VIIIa in the activation of bovine factor X.J. Biol. Chem., vol. 256, pp. 3433-3442.

. van 't Veer C., Golden N.J., Mann K.G. Inhibition of thrombin generation by the zymogen factor VII: implications for the treatment of hemophilia A by factor VIIa. Blood, vol. 95, pp. 1330-1335

. van 't Veer C., Butenas S., Golden N.J., Mann K.G. (1999) Regulation of prothrombinase activity by protein S. Thromb. Haemost., vol. 82, pp. 80-87

. van 't Veer C., Golden N.J., Kalafatis M., Mann K.G. (1997) Inhibitory mechanism of the protein C pathway on tissue factor-induced thrombin generation. Synergistic effect in combination with tissue factor pathway inhibitor. J Biol Chem., vol. 272, pp. 7983-7994.

. van 't Veer C., Mann K.G. (1997) Regulation of tissue factor initiated thrombin generation by the stoichiometric inhibitors tissue factor pathway inhibitor, antithrombin-III, and heparin cofactor-II. J. Biol. Chem. vol. 272, pp. 4367-4377.

. Warn-Cramer B.J., Bajaj S.P. (1986) Intrinsic versus extrinsic coagulation. Kinetic considerations. Biochem. J., vol.239, pp. 757-762.

. Waxman E., Ross J.B., Laue T.M., Guha A., Thiruvikraman S.V., Lin T.C., Konigsberg W.H., Nemerson Y. (1992) Tissue factor and its estracellular soluble domain: the relationship between intermolecular association with factor VIIa and enzymatic activity of this complex. Biochemistry, vol.31, pp. 3998-4003.

. Willems G.M., Lindhout T., Hermens W.T., Hemker H.C. (1991) Simulation model for thrombin generation in plasma. Haemostasis, vol. 21, pp. 197-207.

92. Wuillemin W.A., Eldering E., Citarella F., de Ruig C.P., ten Cate H., Hack C.E. (1996) Modulation of contact system proteases by glycosaminoglycans. Selective enhancement of the inhibition of factor XIa. J. Biol. Chem, vol. 271, pp. 12913-12918

93. Wuillemin W.A., Minnema M., Meijers J.C., Roem D., Eerenberg A.J., Nuijens J.H., ten Cate H., Hack C.E. (1995) Inactivation of factor XIa in human plasma assessed by measuring factorXIa-protease inhibitor complexes: major role for C1-inhibitor. Blood, vol. 85, pp. 1517-1526

94. Zarnitsina V.I., Pokhilko A.V., Ataullakhanov F.I. (1996) A mathematical model for the spatio-temporal dynamics of in-trinsic pathway of blood coagulation. I. The model description. Thrombosis Research, vol. 84, pp. 225-236.

. Zarnitsina V.I., Ataullakhanov F.I., Lobanov A.I., Morozova O.L. (2001) Dynamics of spatially nonuniform patterning in the model of blood coagulation. Chaos, vol.11, pp. 57-69.

. Zimmermann E. (1983) The evolution of the coagulation system from primitive defence mechanisms. Behring Inst Mitt, vol. 73, pp. 1-12.

. Zur M., Nemerson Y. (1980) Kinetics of factor IX activation via the extrinsic pathway, J. Biol. Chem, vol. 255, pp. 5703-5707.

. Zwaal R.F., Comfurius P., Bevers E.M. (1998) Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim Biophys Acta. vol. 1376, pp. 433-453.

. Zwaal R.F., Schroit A.J. (1997) Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry in blood cells. Blood, vol. 89, pp. 1121-32.